5. Những đóng góp mới của đề tài
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Loài sán F. hepatica đã được Linnaeus mô tả năm 1758, còn loài
F. gigantica được Cobbold mô tả năm 1855 và được Kendall phân loại năm 1965.
Tổng kết về bệnh sán lá gan, Kendall (1965) [49] đã kết luận loài F. gigantica phổ biến trên toàn thế giới và ký chủ trung gian của chúng là các loài ốc không dễ dàng phân biệt về mặt hình thái hoặc sinh thái. Tác giả cho rằng, các loài vật chủ trung gian chính ở Nam, Tây và Đông châu Phi là L. natalensis; ở Ấn Độ, Bangladesh và Pakistan là loài L. rufescens. Các dòng L. auricularia sensu lato đóng vai trò là vật chủ trung gian của F. gigantica là ốc nước ngọt vùng nhiệt đới sống ở nước chảy chậm hoặc tĩnh, trong với nồng độ oxy cao và thực vật thủy sinh nhiều.
Một loài ốc khác, loài L. ollula là vật chủ trung gian của sán lá F. gigantica ở Nhật Bản (Ueno và cs, 1975 [56]) và Hawaii (Alicata, 1938 [34]). Về vật chủ chính (vật chủ cuối cùng), cả 2 loài F. hepatica và F. gigantica đều có chung nhiều loài vật chủ ăn cỏ và ăn tạp (Mas - Coma, 1995 [51]).
Mas - Coma và cs (2005) [52] cho biết, sán lá gan lớn (Fasciola spp.) và ký chủ trung gian của chúng ở các nước nhiệt đới phát triển quanh năm. Trâu, bò bị nhiễm sán gầy yếu, tăng trọng chậm, sản lượng thịt, sữa thấp, rất nhiều buồng gan không sử dụng được do sán làm viêm, xơ cứng.
Theo Jorgen Hansen, Brian Perry (1994) [47], nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của ốc là 15 - 260C, khi ở nhiệt độ này chúng đẻ số lượng trứng rất lớn. Trứng nở trong vòng 2 tuần và sau 1 tháng ốc trưởng thành. Một con ốc trong vòng 10 - 12 tuần có thể sinh sản ra hàng ngàn con ốc, ở dưới 100C, ốc không phát triển và ngừng hoạt động. Tuy nhiên, ốc có thể chui vào bùn và sống trong điều kiện bất lợi nhiều tháng.
Guralp và cs (1964) [46] cho biết: thời gian cho sự phát triển đến
Miracidium trong trứng F. gigantica khác nhau phụ thuộc vào nhiệt độ. Khoảng 10 - 11 ngày ở 37 - 38oC, 21 - 24 ngày ở 25oC và 33 ngày ở 17 - 22o
C. Grigoryan (1958) [45] cho rằng, nhiệt độ 24 - 26o
C và pH 6,5 - 7 là tốt nhất và ở điều kiện đó 70 - 80% trứng có thể phát triển. Tác giả cho rằng, trứng không sống được ở nhiệt độ trên 43 - 44o
C, ở điều kiện khô trứng cũng nhanh chết. Trứng F. gigantica không phát triển đồng đều và nở thành Miracidium ở cùng một thời gian, vì vậy ở cùng một điều kiện Miracidium có thể nở trong khoảng một thời gian tới 14 tuần, tăng cơ hội nhiễm vào ốc (Guralp và cs, 1964 [46]). Tác giả cũng thấy rằng trứng bị kích thích nở khi tiếp xúc ánh sáng mặt trời hoặc ánh sáng mạnh. Khi thoát khỏi trứng Miracidium sống trong nước khoảng 18 - 26 giờ (Asanji, 1988 [35]).
Mặc dù là động vật thủy sinh, nhưng ốc - vật chủ trung gian của sán lá gan F. gigantica có thể sống qua một giai đoạn khô, vì thế Mahato và cs (1995) [50] đã cho rằng, sự ngủ hè có thể đóng vai trò quan trọng trong dịch tễ của bệnh sán lá gan ở Nepal. Tác giả đã quan sát thấy ốc L. viridis sống ở bùn khô ít nhất 1 tháng. Tuy nhiên, những loài ốc này thường không vùi mình xuống bùn khi nước khô, mà vẫn nằm trên bề mặt. Vì vậy, chúng dễ bị khô nhiều hơn và bị vật ăn mồi ăn nhiều hơn so với khi chúng vùi mình trongs đất. Tuy nhiên, khi không tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, chúng vẫn sống và đẻ trứng trong một số tuần sau khi môi trường sống của chúng đã bị khô hạn.
Sau khi thoát khỏi ốc, Cercaria hóa nang thành Adolescaria. Khoảng 2/3 bám vào giá thể trong nước (Ueno và cs, 1975 [56]). Phần còn lại không bám vào giá thể mà trôi nổi trong nước (Dreyfuss G. và Rondelaud D., 1994 [41]). Da Costa và cs (1994) [38] thấy, 35% Cercaria thoát khỏi ốc ở đợt thứ 2 trở thành những nang trôi nổi, tỷ lệ giảm ở những đợt tiếp sau.
Kích thước của ốc ở thời điểm nhiễm cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ nang trôi nổi trong nước (Vareille và cs, 1994 [57]). Các tác giả thấy 38% số
Adolescaria từ những ốc lớn trở thành nang trôi nổi, trong khi chỉ 18,2% từ ốc nhỏ thành nang trôi nổi. Tỷ lệ nang trôi nổi cao hơn ở F. gigantica so với F. hepatica. Dreyfuss G. và Rondelaud D. (1997) [42] cho thấy, những
Adolescaria này có thể là nguồn lây nhiễm F. gigantica quan trọng hơn so với
F. hepatica khi gia súc uống nước từ môi trường.
Theo báo cáo gần đây, Adolescaria đã được tìm thấy trong môi trường nước với tỷ lệ dưới 10% (Vareille Morel và cs, 1994 [57]).
Nhiều nhà ký sinh trùng học trên thế giới cho biết, bệnh sán lá gan lớn thường phát triển theo mùa. Vào mùa mưa tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở gia súc cao hơn nhiều so với mùa khô (Ripert và cs, 1987) [53]. Vì trong vòng truyền
bệnh có vai trò của thực vật thủy sinh, nên sự nhiễm bệnh còn phụ thuộc vào mùa phát triển của chúng.
Thời gian trứng phát triển ở nhiệt độ khác nhau thì hoàn toàn khác nhau, khoảng 60 ngày ở 12°C đến 10 ngày ở 30°C (Soulsby, 1982 [55]). Tỷ lệ phát triển của trứng phụ thuộc vào nhiệt độ. Ở cao nguyên Kenya, nhiệt độ trung bình từ 10 - 22°C, sự phát triển của trứng F. gigantica từ 52 - 109 ngày (Dinnik J. A. và Dinnik N. N., 1956 [39]), trong khi ở nhiệt độ ổn định 26°C, thời gian phát triển là 17 ngày (Dinnik J. A. và Dinnik N. N., 1963 [40]).
Cercaria được thải ra tới 15 đợt (thường 3 hoặc ít hơn) (Dreyfuss và Rondelaud, 1994 [41]). Sharma và cs (1989) [54] cho biết, ở 25 - 27°C,
Cercaria bắt đầu ra khỏi ốc sau 20 ngày gây nhiễm, nhưng nhiều nhất khoảng 46 - 50 ngày sau khi nhiễm (Asanji, 1988 [35]). Thời gian này sẽ dài hơn khi nhiệt độ giảm đi và có thể kéo dài đến 197 ngày (Dinnik J. A. và Dinnik N. N., 1963 [40]). Khoảng 80% Cercaria ra khỏi ốc vào buổi tối (Guralp và cs, 1964 [46]; Da Costa và cs, 1994 [38]), mỗi đợt có khoảng 50 - 70 Cercaria (Da Costa và cs, 1994 [38]). Tổng số Cercaria có thể cós trong mỗi ốc thường là hàng trăm, nhưng có thể khác nhau từ vài trăm đến hàng nghìn. Bitakaramire P. K. (1968) [36] đã thu được trung bình 653 Adolescaria của F. gigantica/ốc L. natalensis được gây nhiễm, nhưng Grigoryan (1958) [45] đã thu được 2.700
Cercaria/ốc, Guralp và cs (1964) [46] thu được 7.179 Cercaria/ốc trong thời gian 75 ngày.
Boray (1966) [37] cho rằng, tại Autralia, ở nhiệt độ 22 - 240
C, sau 28 - 52 ngày gây nhiễm Miracidium vào ốc - ký chủ trung gian sẽ thu được Cercaria. Tại Brazil, Gomes (1985) [44] đã thu được Cercaria sau 56 ngày gây nhiễm
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu
- Bệnh sán lá gan (Fasciolosis) ở trâu, bò.
- Trứng và ấu trùng sán lá gan Fasciola spp.
- Các loài ốc nước ngọt – ký chủ trung gian của sán lá gan Fasciola spp.
* Thời gian nghiên cứu
- Từ năm 2011 – 2012.
* Địa điểm nghiên cứu
- Đề tài được thực hiện ở các nông hộ, các trại chăn nuôi trâu, bò gia đình và tập thể với các quy mô khác nhau ở 4 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên: Võ Nhai, Đại Từ, Định Hoá, Đồng Hỷ.
- Địa điểm xét nghiệm mẫu:
+ Bộ môn Bệnh Động vật và phòng Chẩn đoán bệnh – Khoa Chăn nuôi thú y – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
+ Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội + Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Mẫu nghiên cứu
- Mẫu phân trâu, bò, mẫu đất (cặn) nền chuồng, mẫu đất ở xung quanh chuồng trâu, bò.
- Mẫu đất bề mặt, mẫu nước chỗ trũng trên bãi chăn thả trâu, bò, mẫu cỏ thuỷ sinh.
- Mẫu ốc thu thập từ các ao, ruộng, suối trong khu vực chăn thả trâu, bò.
- Trứng sán lá Fasciola spp. phân lập từ phân của trâu, bò bệnh (để bố trí các thí nghiệm).
- Trâu, bò ở các lứa tuổi (để mổ khám sán lá gan).
- Kính hiển vi quang học, kính lúp, máy ly tâm, hóa chất và các dụng cụ thí nghiệm khác.
2.2.2. Dụng cụ và hoá chất
- Kính hiển vi quang học, kính lúp.
- Dụng cụ xét nghiệm mẫu: cốc thuỷ tinh, đĩa petri, lam kính, la men, lưới lọc phân và các dụng cụ thí nghiệm khác.
- Nước muối sinh lý.
- Các bình thủy tinh kích thước 60 x 30 x 30 cm để nuôi ốc thí nghiệm. - Các chậu thủy tinh, khay nhựa, khay men để bố trí các thí nghiệm theo dõi thời gian sống của trứng sán lá gan trong phân trâu, bò và đất.
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Xác định loài sán lá gan lớn ký sinh ở trâu, bò tại một số huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên
2.3.2. Đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan lớn ở trâu, bò
2.3.2.1. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu và bò
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan ở các địa phương - Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan theo tuổi trâu, bò - Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan theo mùa vụ
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan theo tính biệt trâu, bò
2.3.2.2. Nghiên cứu về sự ô nhiễm trứng và ấu trùng sán lá gan ở ngoại cảnh và trong ký chủ trung gian
- Sự ô nhiễm trứng sán lá gan ở chuồng trại, bãi chăn thả
- Xác định loài ốc nước ngọt – ký chủ trung gian của sán lá gan Fasciola spp.
2.3.2.3. Nghiên cứu về thời gian sống của trứng sán lá gan lớn ở ngoại cảnh (khi chưa rơi vào môi trường nước)
- Thời gian sống của trứng sán lá gan trong phân trâu, bò - Thời gian sống của trứng sán lá gan trong đất
2.3.2.4. Nghiên cứu về thời gian Miracidium thoát vỏ và thời gian tồn tại của Miracidium trong nước
- Thời gian Miracidium thoát vỏ từ khi trứng rơi vào môi trường nước - Thời gian Miracidium tồn tại trong nước (khi không gặp ký chủ trung gian).
2.3.2.5. Nghiên cứu thời gian phát triển của ấu trùng sán lá gan trong ốc – ký chủ trung gian
- Thời gian hoàn thành các giai đoạn ấu trùng của sán lá gan trong ốc - ký chủ trung gian.
- Thời gian từ khi trứng sán lá gan rơi vào môi trường nước đến khi hình thành Adolescaria.
2.3.3. Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh sán lá gan cho trâu bò ở tỉnh Thái Nguyên
- Xác định hiệu lực tẩy sán lá gan trâu, bò của 2 loại thuốc: Han-Dertil B và Bio - Alben.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp xác định loài sán lá gan lớn ký sinh ở trâu, bò tại một số huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên
- Mổ khám, thu thập sán lá gan ở ống dẫn mật trâu, bò. Định danh loài sán lá gan theo khóa định loại của Nguyễn Thị Lê (1996) [11], căn cứ vào đặc điểm hình thái, kích thước và cấu tạo của sán trưởng thành để xác định.
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò ở một số huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên
2.4.2.1. Quy định những yếu tố cần xác định liên quan đến tình hình nhiễm sán lá gan trâu, bò
* Tuổi trâu: Phân theo 4 lứa tuổi + Dưới 1 – 2 năm tuổi + 2 – 5 năm tuổi + 5 – 8 năm tuổi + Trên 8 năm tuổi
* Tuổi bò: Phân theo 4 lứa tuổi + Dưới 1– 2 năm tuổi + 2 – 5 năm tuổi + 5 – 8 năm tuổi + Trên 8 năm tuổi
* Mùa vụ: Mùa vụ trong năm được theo dõi gồm 4 mùa - Xuân : Tháng 2 - tháng 4;
- Hè : Tháng 5 - tháng 7; - Thu : Tháng 8 - tháng 10;
- Đông : Tháng 11 - tháng 1 năm sau.
2.4.2.2. Bố trí thu thập mẫu
- Thu thập mẫu theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc. Chọn 4 huyện trong tỉnh, mỗi huyện chọn 5 xã để lấy mẫu.
Mẫu được thu thập ngẫu nhiên tại các nông hộ, trang trại chăn nuôi trâu, bò tại 4 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên.
- Các loại mẫu được xét nghiệm ngay trong ngày hoặc sau khi bảo quản theo quy trình bảo quản mẫu trong nghiên cứu ký sinh trùng học.
Bảng 2.1: Sơ đồ bố trí thu thập mẫu
Loại mẫu Số lƣợng mẫu Số huyện/tỉnh Số xã/huyện
Mẫu phân 3.147 4 5
Mẫu nền chuồng 1.218 4 5
Mẫu đất bề mặt xung quanh
chuồng 1.218 4 5
Mẫu đất bề mặt bãi chăn 296 4 5
Mẫu nước đọng ở bãi chăn 274 4 5
Mẫu ốc nước ngọt 1.137 4 5
2.4.2.3. Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan * Phương pháp thu thập mẫu phân
- Thu nhập mẫu phân ngẫu nhiên ở trâu, bò nuôi tại nông hộ, trại tập thể và gia đình. Lấy phân trực tiếp từ trực tràng con vật. Để riêng mỗi mẫu vào một túi nilon nhỏ và mỗi túi đều có nhãn ghi: loại gia súc (trâu, bò), địa điểm, tuổi, trạng thái phân, thời gian lấy mẫu và các biểu hiện lâm sàng của trâu, bò. Ngoài ra, căn cứ vào những yếu tố cần xác định có liên quan đến đặc điểm dịch tễ để lấy mẫu cho tương đối đồng đều về các yếu tố khác.
* Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan
Xác định bằng phương pháp lắng cặn Benedek (1943)
Nguyên lý: lợi dụng tỷ trọng của trứng sán lá gan nặng hơn của nước lã nên trứng sẽ bị chìm xuống dưới.
Cách tiến hành: mỗi mẫu lấy một lượng phân khoảng 5 - 10 gam cho vào cốc thủy tinh sạch, cho khoảng 100 - 150 ml nước lã sạch vào, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho tan phân, lọc qua lưới lọc (mắt lưới có đường kính 0,5 - 1
mm) vào một cốc thuỷ tinh khác. Bỏ cặn bã. Đổ thêm nước cho đầy cốc, để lắng cặn từ 15 - 20 phút, cẩn thận gạn nước trên đi, lấy cặn, cho thêm nước vào đầy cốc, để lắng. Lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi nước trong, gạn phần nước trong phía trên đi, dùng công tơ gút hút cặn nhỏ lên phiến kính, soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần để tìm trứng sán lá gan. Những mẫu phân tìm thấy trứng sán lá gan được xác định là có nhiễm, ngược lại là không nhiễm.
* Phương pháp xác định cường độ nhiễm sán lá gan
Xác định cường độ nhiễm sán lá gan bằng phương pháp đếm trứng Mc. Master (đếm số trứng/gam phân trên buồng đếm Mc.Master theo tài liệu của Jorgen Hansen và cs (1994) [47]).
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu trứng và ấu trùng sán lá gan ở ngoại cảnh và ký chủ trung gian
2.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu sự ô nhiễm trứng sán lá gan ở chuồng và khu vực xung quanh chuồng nuôi trâu, bò
* Phương pháp thu thập mẫu
- Mẫu đất hoặc cặn nền chuồng trâu, bò: Tại mỗi ô chuồng, lấy mẫu đất (cặn) ở 4 góc chuồng và ở giữa chuồng, trộn đều được một mẫu xét nghiệm (khoảng 80 – 100g/mẫu). Mỗi mẫu được để riêng trong túi nilon, có nhãn ghi địa điểm và thời gian lấy mẫu.
- Mẫu đất bề mặt xung quanh chuồng nuôi: Lấy mẫu đất bề mặt tương tự như cách lấy mẫu cặn nền chuồng.
* Phương pháp xét nghiệm mẫu
Xét nghiệm bằng phương pháp lắng cặn Benedek để phát hiện trứng sán lá gan.
2.4.3.2. Phương pháp nghiên cứu sự ô nhiễm trứng sán lá gan ở khu vực bãi chăn thả
* Phương pháp thu thập mẫu ở khu vực bãi chăn thả trâu, bò
- Mẫu đất bề mặt ở khu vực bãi chăn thả trâu, bò: Tại mỗi khu vực chăn thả, cứ khoảng 20 – 30 m2
lấy ngẫu nhiên ở vị trí 4 góc và ở giữa, trộn đều được một mẫu xét nghiệm, khối lượng khoảng 80 – 100g/mẫu. Mỗi mẫu được để riêng trong túi nilon, có nhãn ghi địa điểm và thời gian lấy mẫu.
Mẫu nước ở những chỗ trũng trên khu vực bãi chăn thả: Dùng que khuấy đều nước, lấy cốc thủy tinh múc khoảng 400 - 500 ml/ vũng, mỗi mẫu
