- Dẫn dụ: công trùng tìm đ ến hoa được là do hương thơm của hoa tỏa ra. Ở một số loài hoa, tinh dầu của nó có khảnăng dẫn dụ côn trùng đến giúp cho hoa thụ phấn.
- Bảo vệ: tinh dầu của thực vật góp phần bảo vệ chúng chống lại các loài ăn cỏ.
- Hỗ trợ phát triển: allelopathy được định nghĩa là khả năng đặc biệt của cây cối nhằm tạo ra những hóa chất để ngăn chặn hoặc giúp ích cho những cây chung quanh. Những hóa chất này ảnh hưởng đến sự sinh tồn và phát triển bao gồm ngăn chặn sự nẩy mầm của hạt, làm biến dạng rễ cây, làm chậm sự phát triển cây,… Một số sản phẩm của sự biến dưỡng thứ cấp có vai trò hỗ trợ sự phát triển của cây chủ. Trong đất, nó đóng vai trò như ch ất độc cho thực vật (phytotoxicity) thông qua việc ngăn chặn hoặc kéo dài thời gian nảy mầm hạt giống của những cây khác.
- Dung môi hữu cơ: một số monoterpen không đảm nhiệm những chức năng riêng lẻ mà chúng đóng vai trò dung môi hữu cơ cho một số hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học trong cây.
- Hoạt tính kháng sinh: khi các động vật ăn cỏ hoặc một nguyên nhân cơ học nào đó làm tổn hại các cơ quan của cây, tinh dầu từ các mô thoát ra bảo vệ vết thương không cho cây bị nhiễm trùng thứ cấp (Lê Ngọc Thạch, 2003).
1.3.5 Sự dùng tinh dầu trong nông nghiệp và y dược
- Kháng khuẩn: hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu trong điều kiện phòng thí nghiệm được hiểu như là khảnăng ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong điều kiện in vitro. Cách tác dụng lên vi khuẩn của các tinh dầu thường giống nhau, đó là tác dụng vào tế bào chết hơn là lên vách tế bào. Cơ chế kháng khuẩn của các cấu phần trong tinh dầu vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu. Tinh dầu còn có khảnăng tiêu diệt tếbào ung thư hoặc có hoạt tính kháng HIV trong điều kiện in vitro. Prabuseenivasan và cs (2006) đã
khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 21 loại tinh dầu thực vật, trong đó có 19 loại tinh dầu có hoạt tính kháng khuẩn như tinh dầu chanh, cam, đinh hương,… Tinh dầu quế biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ thấp,… - Diệt nấm: tinh dầu có hoạt tính diệt nấm ngay ở nồng độ thấp. Ví dụnhư tinh
dầu kinh giới tây với nồng độ 1 – 10 µl/ml đã làm giảm sự phát triển của các loài nấm sợi nhỏ. Do đó trong cây này, tinh dầu giữ vai trò bảo vệ các mô cây khi bị các loài vật ăn cỏ làm tổn thương.
- Diệt côn trùng: hoạt tính diệt côn trùng của tinh dầu có thể biểu hiện dưới nhiều dạng như: dẫn dụ côn trùng đến sa vào bẫy, tiêu diệt trực tiếp như một chất độc đối với côn trùng, tiêu diệt gián tiếp thông qua việc ngăn chặn một giai đoạn phát triển của côn trùng. Ngoài ra, một số tinh dầu còn có hoạt tính xua đuổi côn trùng. Nhờ kinh nghiệm dân gian, chúng ta có thể tìm thấy khả năng sử dụng tinh dầu qua hệ thực vật phong phú ở nước ta. Nhiều sản phẩm thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật có thể dùng như thuốc trừ sâu hoặc thuốc kiềm hãm sự phát triển của sâu bọ đã được biết đến. Ngoài ra ngày nay người ta có khuynh hướng ngày càng thiên về sử dụng các thuốc trừ sâu có độc tính thấp đối với con người, thú nuôi và nhanh chóng phân hủy sau khi sử dụng nên những thuốc sát trùng có nguồn gốc thực vật như tinh dầu đang được lưu tâm nghiên cứu sử dụng.
- Kháng oxi hóa: sự oxi hóa thường xuất hiện trong những thực phẩm để lâu ngày vì trong đó có chứa rất nhiều hợp chất bão hòa và những hợp chất dễ bị oxi hóa bởi oxygen trong không khí. Sự oxi hóa này sẽ đưa đến sự hư thối, mất phẩm chất,… của thực phẩm. Những tinh dầu có chứa các dẫn xuất phenol như hương nhu, đinh hương, húng,…ngoài khảnăng chống lại sự oxi hóa trong thực phẩm, còn có khả năng tiêu diệt vi trùng cao hơn các tinh dầu phi – phenol khác. Ở Trung Quốc, đã có những nghiên cứu nhận thấy rằng tinh dầu tỏi ức chế sự peroxide hóa lipid và một số tinh dầu khác cũng có hoạt tính kháng oxi hóa. Các tinh dầu này đều có chứa dẫn xuất
phenol là cấu phần chính. Những hợp chất này bắt lấy gốc tự do, không cho phản ứng peroxide hóa xảy ra, bảo vệ các lipid.
- Dược phẩm: tinh dầu là loại dược phẩm được sử dụng nhiều nhất trong y học cổ truyền. Nhờ có chứa tinh dầu mà một số dược thảo có mùi thơm đặc trưng. Tinh dầu có nhiều tác dụng điều trị khác nhau. Có loại tác dụng trên hệ thần kinh trung ương, có loại lại kích thích dịch tiêu hóa, dịch dạ dày, dịch ruột và dịch mật làm ta ăn ngon. Chúng có thể giúp tiêu hóa tốt và điều hòa các chức năng của ruột. Người ta dùng dung dịch etanol – nước ngâm với các vị thuốc có tinh dầu để xoa chống bệnh thấp khớp. Chúng tác dụng bằng cách tăng sự dồn máu tại các vùng xử lý. Mỗi tinh dầu có thành phần hóa học và cấu phần chính khác nhau nên có những hoạt tính trị bệnh khác nhau (Lê Ngọc Thạch, 2003).
1.4 Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật đến sự tăng trưởng củ và tích lũy hợp chất thứ cấp trưởng củ và tích lũy hợp chất thứ cấp
Ở thực vật, chất điều hoà tăng trưởng đóng vai trò quan trọng trong các quá trình hình thành các cơ quan (thân, rễ, củ, chồi,…) cũng như sự chuyển đổi từ giai đoạn tăng trưởng sang giai đoạn phát triển hay tích lũy các chất dinh dưỡng. Chính vì thế, sự cân bằng hormone trong tế bào thực vật có ý nghĩa quy ết định. Sự cân bằng được thiết lập trên cơ sở hai nhóm có hoạt tình trái ngư ợc nhau: nhóm có tác dụng kích thích sinh trưởng và nhóm có tác dụng ức chế sinh trưởng (Vũ Văn Vụ, 1997).
1.4.1 Auxin
Auxin kích thích phân chia của tượng tầng, đồng thời giúp sự phân hóa của các mô dẫn (libe và mạch mộc). Auxin có khả năng cảm ứng trực tiếp sự phân hóa tế bào nhu mô thành các tổ chức mô dẫn (Bùi Trang Việt, 2000).
Ở Pinellia ternate khi bổ sung 2,4-D ở nồng độ thấp vào môi trường nuôi cấy giúp cảm ứng tạo củ, với 2,4-D 0,2 mg/l tỉ lệ cảm ứng tạo củ từ cuống lá và lá
tương ứng là 100% và 89,4%. Nhưng khi tiếp tục tăng nồng độ 2,4-D lên 0,5 mg/l thì tỉ lệ tạo củ giảm đi. Xử lí 2,4-D 2 mg/l sẽ hình thành mô sẹo và từ đó cảm ứng tạo củ với tỉ lệ cao (98,2 – 100%). Tương tự như vậy khi xử lý IAA và NAA 0,2 mg/l tỉ lệ tạo củ cao (81,8 – 92%) (Wang và cs, 2009).
Sau bốn tuần nuôi cấy trên môi trường tạo củ (MS ½ bổ sung NAA 0,5 mg/l)
ở Dioscorea floribunda đã hình thành các củ trên không (15 củ/1 cây) (Senguptavà
cs, 1984).
1.4.2 Gibberellin
Gibberelin được coi là chất cản sự tạo củ ở cây Pinellia ternate. Khi phân tích sự thay đổi và chức năng của năm nhóm hormone nội sinh (IAA, GA3, ABA, zeatin và acid jasmonic) trong sự hình thành củ đã cho thấy rằng hàm lượng IAA, ABA, zeatin và acid jasmonic tăng trong quá trình h ình thành và tăng trư ởng củ nhưng GA3
1.4.3 Acid abscisic
giảm mạnh (Wang và cs, 2009).
Trên cơ sở tác động của các loại hormone thực vật, các nhà nghiên cứu đã xây dựng giả thuyết về sựđiều hoà của chúng trong quá trình hình thành củdưới hai hệ phức hợp: GA/ABA được hình thành trong lá và ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành củ; auxin/cytokinin tác động trực tiếp đến sự hình thành củ. Trong điều kiện ngày dài, nhiệt độ cao, cân bằng GA/ABA nghiêng về phía GA, sự hình thành củ bị ức chế. Trong điều kiện ngày ngắn, nhiệt độ thấp, cân bằng nghiêng về phía ABA sẽ kích thích sự hình thành củ. Tương tự, sự cân bằng auxin/cytokinin nghiêng về phía cytokinin sẽ kích thích hình thành củ (Vũ Văn Vụ, 1997).
Ở khoai môn hoạt tính ABA cao giúp hình thành củ con, ABA được xem là chất kích thích tượng củ, đặc biệt là giai đoạn đầu của sự hình thành củ do làm mất tác dụng của gibberellin.
ABA là chất ức chế sinh trưởng, ngăn cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngủ của chồi và hạt. Nó được hình thành trong lá, kích thích sự phình to của củ. Một số
nghiên cứu cho thấy cơ chế tác động của ABA lên quá trình tạo củ là do tác dụng kích thích hấp thu sucrose trong các tế bào nhu mô dự trữ từcác mô libe do đó làm tăng áp suất thẩm thấu (Nguyễn Du Sanh, 1998).
1.4.4 Cytokinin
Bổ sung BAP 0,2 – 0,5 mg/l hay kinetin 0,2 – 2 mg/l hay zeatin 0,2 – 2 mg/l vào môi trường nuôi cấy cuống lá và lá của Pinellia ternate sẽ cảm ứng tạo củ với tỉ lệ cao (73,8 – 100%). Ngoài ra, sự kết hợp giữa BAP 0,5 mg/l và NAA 0,2 mg/l sẽ làm gia tăng số lượng củ cũng như giúp củ tăng trưởng đường kính (Wang và cs, 2009).
Ở Xanthosoma sagittifolium, nuôi cấy đỉnh chồi trên môi trường MS chứa
sucrose 80 g/l có bổ sung BAP 30µM cho khả năng tạo củ cao (Omokolo và cs, 2003).
BA 1 µM có tác động tích cực đến việc tích lũy sinh khối của củ cây
Curcuma longa (Matthew và cs, 2008). Ở Curcuma zedoaria, kết quả đã tạo củ
trong vòng 7 – 10 tuần nuôi cấy trên các môi trường khác nhau, tỉ lệ thân rễ tạo thành tốt nhất ở môi trường chứa BAP 4 mg/l. Ảnh hưởng tương tự của BAP và NAA trong tạo củ cũng đã được kiểm tra trên cả chi Curcuma. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trên Curcuma aromatic. Tuy nhiên, một số tác giả nhận thấy BAP như là chất ức chế tạo củ trong Nghệ vàng (Anisuzzaman, 2008).
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Cytokinin còn giúp sự gia tăng kích thước tế bào. Trong thân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài, nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ) (Bùi Trang Việt, 2000).
1.4.5 Acid jasmonic
Trong sự hình thành củ in vitro ở Dioscorea cayenensis, JA 0,1µl cảm ứng tạo củ sớm hơn. JA (1, 0,3 và 0,1 µl) làm tăng trọng lượng và chiều dài củ sau 60 và 120 ngày nuôi cấy (Ovonovà cs, 2009).
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 VẬT LIỆU
2.1.1 Vật liệu dùng để phân tích và xử lý.
- Củ Nghệđen cấp một từcác cây được trồng trong vườn, ở huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai, ở giai đoạn cây 4, 6, 8 và 10 tháng trồng.
- Củ cấp một, hai và ba của cây Nghệ đen trong vườn ở giai đoạn cây 10 tháng trồng.
- Cây Nghệ đen 9 tháng trồng và củ sau một tháng xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
2.1.2 Vật liệu dùng trong nuôi cấy
- Chồi mầm tái lập tăng trưởng trên củ Nghệ đen trong vườn sau hai tuần trồng.
- Cây Nghệđen in vitro sáu tuần tuổi được trồng với môi trường MS cơ bản. - Cây Nghệ đen in vitro ba tháng tuổi được trồng với môi trường MS có bổ sung BA 2 mg/l và IBA 0,5 mg/l.
2.1.3 Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm
- Khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) từ cây mầm 72 giờ tuổi được dùng trong sinh trắc nghiệm đo hoạt tính auxin và acid abscisic.
- Tử diệp dưa chuột (Cucumis sativus L.) 24 giờ tuổi được dùng trong sinh trắc nghiệm đo hoạt tính cytokinin.
- Cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.) 24 giờ tuổi được dùng trong sinh trắc nghiệm đo hoạt tính gibberellin.
2.2 PHƯƠNG PHÁP
2.2.1 Quan sát cấu trúc giải phẫu
Các lát cắt ngang và dọc qua thân cây Nghệ đen in vitro ba tháng tuổi được quan sát dưới kính hiển vi quang học hoặc sau khi nhuộm hai màu đỏ carmin và xanh iod.
2.2.2 Theo dõi sự tích lũy tinh dầu ở củ Nghệ đentrong vườn
Có hai phương pháp theo dõi sự tích lũy tinh dầu ở cây Nghệđen trong vườn, bao gồm:
Củ cấp một (từ củ mẹ đầu tiên được trồng) ở giai đoạn 4, 6, 8 và 10 tháng trồng của cây Nghệ đen trong vườn được chia thành ba phần có chiều dài bằng nhau. Cắt ngang qua phần giữa củ thành nhiều lát cắt. Chọn 15 lát cắt, đếm số hạt tinh dầu trong thị trường khi dùng vật kính x10 của các lát cắt. Kết quả là giá trị trung bình của các lần đếm trên 15 lát cắt. Lặp lại ba lần trên ba củ khác nhau.
Định lượng tinh dầu: phần giữa của củ cấp một, cấp hai và cấp ba (khi chia củ cấp một, cấp hai và cấp ba thành ba phần có chiều dài bằng nhau) ở giai đoạn 10 tháng tuổi của cây Nghệ đen trong vườn được dùng để định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất cuốn hơi nước (Nguyễn Thị Kim Cúc và cs, 2009; Lê Ngọc Thạch, 2003). Cân 100 g mẫu, nghiền nhỏ cho vào bình cầu. Thêm 300 ml nước vào bình cầu. Đậy kín bình và gắn vào ống sinh hàn hồi lưu, phía dưới hứng bằng buret sao cho giọt chất lỏng chảy từ đuôi ống sinh hàn xuống sẽ rớt vào buret. Đun sôi nhẹ trong 3 giờ. Hơi nước và hơi tinh dầu bốc lên gặp lạnh ngưng tụ lại và rơi xuống ống hứng. Tinh dầu nhẹ hơn nước sẽ tách ra khỏi lớp nước và nổi lên trên. Sau 3 giờ, quan sát thấy lượng tinh dầu trong ống không thay đổi đáng kể, kết thúc định lượng. Dùng kim tiêm để hút tinh dầu ra và đọc thể tích tinh dầu thu được.
2.2.3 Xác định trọng lượng khô
Sấy khô 5 g trọng lượng tươi phần giữa của củ cấp một (khi chia củ thành ba phần có chiều dài bằng nhau) giai đoạn 4, 6, 8 và 10 tháng tuổi của cây Nghệ đen
trong vườn ở 1050C trong 2 giờ, tiếp theo ở 800
2.2.4 Đo cường độ hô hấp
C cho đến khi trọng lượng không đổi (khoảng 72 giờ) đểxác định trọng lượng khô (Grodzinxki, 1981).
Đo cường độ hô hấp (lượng oxygen hấp thu/g TLT/giờ) bằng máy Hansatech với điện cực oxygen, ở 270C, trong tối. Trong sự đo, phần giữa của củ cấp một ở giai đoạn 4, 6, 8, và 10 tháng tuổi của cây Nghệ đen trong vườn được cho vào buồng đo của máy.
Khi có sự hấp thu O2 làm thay đổi áp suất O2 trong buồng đo, điện cực của máy nhận biết những thay đổi này và thay đổi hiệu điện thế tương đương với nồng độ O2 trong buồng kín. Trên cơ sở sựthay đổi hiệu điện thế của điện cực, chương trình phần mềm của máy sẽ tính ra được nồng độ O2
2.2.5 Xác định lượng tinh bột
của mẫu.
Hàm lượng tinh bột phần giữa của củ cấp một (khi chia củ cấp một thành ba phần có chiều dài bằng nhau) ở giai đoạn 4, 6, 8 và 10 tháng tuổi của cây Nghệ đen trong vườn được xác định bằng phương pháp của Coombs và cs (1987).
- Lập đường chuẩn
Pha glucose theo các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 µg/l. Nhuộm dung dịch glucose bằng phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ glucose: phenol 5%: H2SO4 đậm đặc (1: 1: 5 theo thểtích). Đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm với chuẩn là nước cất: phenol 5%: H2SO4 đậm đặc (1: 1: 5 theo thể tích). Từ các giá trị thu được, vẽ đường chuẩn để dùng cho việc xác định hàm lượng tinh bột trong các thí nghiệm sau.
- Đo hàm lượng tinh bột trong củ.
Nghiền 2 g củ, chiết đường trong củ bằng cồn 900 nóng theo tỉ lệ cồn : mẫu (10: 1). Lọc lặp lại ba lần. Tiếp tục chiết đường còn lại trong phần bã bằng cồn 800
Phần bã còn lại được sấy khô ở 70 0C trong 30 phút, thêm 5 ml nước cất, đun cách thủy trong 15 phút, để nguội, thêm 2 ml HClO4 9,2 N, thêm nước cất tới 10 ml và ly tâm 4000 vòng trong ba phút. Tiếp tục ly trích phần cặn sau ly tâm với 2 ml HClO4
2.2.6 Ly trích và đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
4,6 N. Gộp chung các phần lỏng để xác định hàm lượng đường theo đường