- Salmonella
3.3.2. Phương pháp lấy mẫu, kiểm tra, phân tích phòng thí nghiệm
3.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu trên bề mặt thân thịt (theo QCVN 01-04-2009- BNNPTNT)
a) Chuẩn bị môi trường bảo quản, vật liệu và dụng cụ lấy mẫu
- Dung dịch pha loãng nước muối sinh lý vô trùng, ñược phân phối vào
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 20 - Túi bằng chất dẻo vô trùng.
- Miếng gạc vô trùng (cần 4 miếng/1 thân thịt).
- Khuôn lấy mẫu vô trùng, kích thước 5cm x 5cm, có diện tích trống bên trong 25cm2.
- Bông thấm nước có tẩm Etanol 70% ñựng trong chai. - Găng tay vô trùng. - Kẹp vô trùng. - Kéo. - Dụng cụ hút vô trùng. - Thùng xốp bảo quản mẫu với túi ñá lạnh. b) Cách tiến hành
Sử dụng 10ml dung dịch pha loãng nước muối sinh lý vô trùng làm ẩm miếng gạc, miếng mút hay tăm bông trước khi lấy mẫu. Miếng hấp phụ phải ñược làm ẩm ít nhất 5 giây trong dung dịch pha loãng. Sử dụng khuôn lấy mẫu ñịnh vị
kích thước 5cm x 5cm (sao cho diện tích lấy mẫu ñảm bảo 100 cm2) và dùng kẹp vô trùng ñặt miếng hấp phụ vào khuôn, sau ñó di kẹp vô trùng trên bề mặt miếng hấp phụ theo chiều dọc, ngang, chéo trong khuôn mỗi chiều 10 lần, không ít hơn 20 giây. Cho miếng hấp phụ vào túi bằng chất dẻo vô trùng, thêm tiếp lượng dung dịch pha loãng nước muối pepton vô trùng sao cho ñủ 25ml.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 21
Hình 3.1. ðường ñi và hướng lau dọc theo thân thịt khi lấy mẫu
3.3.2.2. Phương pháp xác ñịnh tổng số VKHK trong thịt
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên thân thịt ñược xác ñịnh theo qui trình TCVN 5667:1992, tóm tắt như sau:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
a) Dùng gạc vô khuẩn ñược làm ướt trước bằng nước muối sinh lý và có tổng diện tích là 25 cm2 dán lên các vị trí khác nhau của bề mặt mẫu cần dán sao cho toàn bộ diện tích giấy thấm tiếp xúc trực tiếp với bề mặt mẫu. Sau 2 phút, chuyển toàn bộ số gạc trên vào ống nghiệm ñã chứa sẵn 10ml dung dịch ñệm pepton.
b) Chuyển toàn bộ lượng mẫu trong ống nghiệm vào bình tam giác dung tích 100ml chứa khoảng 10 viên bi thuỷ tinh vô khuẩn. Tráng ống nghiệm chứa mẫu bằng dung dịch ñệm pepton và ñổ cả vào bình chứa mẫu, lắc nhẹ sau ñó cho thêm dung dịch ñệm pepton tới khoảng 100ml.
c) ðể lắng hoặc tiến hành ly tâm dung dịch mẫu khoảng 5 phút ở tốc ñộ
200 vòng/phút. Gạn lấy lớp dung dịch trong vào bình ñịnh mức dung tích 100ml và cho thêm dung dịch ñệm pepton tới vạch mức 100ml (tương ñương với 100cm2 bề mặt mẫu ñược chuẩn bị). Dung dịch này ñược gọi là dung dịch
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 22 huyền phù ban ñầu. Cần tiến hành kiểm tra ngay sau khi chuẩn bị xong dung dịch, nếu chưa kiểm tra, dung dịch cần ñược bảo quản ở 00C ñến 50C nhưng không quá 1h.
Bước 2: Pha loãng mẫu
Dùng dung dịch ñệm pepton ñể pha loãng dung dịch huyền phù ban ñầu theo tỉ lệ 1/10 tới các ñộ pha loãng thập phân khác nhau (10-1, 10-2…10n). Cần căn cứ mức ñộ nhiễm khuẩn của mẫu ñể tiến hành pha loãng dung dịch mẫu tới các ñộ pha loãng phù hợp.
Bước 3: Tiến hành nuôi cấy
a) Với mỗi mẫu phải nuôi cấy ít nhất 3 ñộ pha loãng liên tiếp, mỗi ñộ
pha loãng nuối cấy 2 ñĩa, phải dùng pipet riêng trong mỗi ñộ pha loãng.
b) Dùng pipet khác nhau lấy 1ml dung dịch mẫu ở các ñộ pha loãng khác nhau cho vào giữa các ñĩa petri. Rót vào mỗi ñĩa khoảng 15ml môi trường thạch PCA. Lắc vòng tròn 5 lần theo chiều kim ñồng hồ và 5 lần ngược lại ñể trộn ñều môi trường và dung dịch mẫu. ðặt các ñĩa chứa môi trường trên mặt phẳng ngang sao cho môi trường ñông tự nhiên. Thời gian từ
khi pha loãng mẫu ñến khi nuôi cấy xong không quá 20 phút.
c) Nếu nghi trong sản phẩm có chứa các vi sinh vật mà khuẩn lạc của chúng có thể mọc lan trên bề mặt môi trường thì sau khi môi trường ñã ñông rót thêm 4ml thạch màng lên bề mặt ñĩa.
d) Khi môi trường ñã ñông, lật úp các ñĩa Petri và ñặt vào tủấm ñã duy trì ở 30 ± 10C trong 72 h.
Bước 4: Tính kết quả
Cứ sau 24h ñếm sơ bộ số khuẩn lạc ñã mọc và sau 72h ñếm chính thức
ñể tính kết quả.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 23 tương quan nghịch giữa ñộ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên ñó.
ðếm số khuẩn lạc mọc trên mỗi ñĩa Petri, chỉ ñếm những ñĩa có số
khuẩn lạc mọc riêng biệt và từ 15 ñến 300 khuẩn lạc.
ðếm tất cả số khuẩn lạc mọc trong mỗi ñĩa, trong trường hợp số lượng khuẩn lạc lớn và phân bốñều, có thể phần ñáy ñĩa theo ñường kính thành các phần ñều nhau có bội số là 2 ñểñếm một phần sau ñó nhân kết quả với tổng số phần ñã chia.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2 mẫu thử ( X1) ñược quy ra tổng số
vi khuẩn hiếu khí có trong 1ml dung dịch huyền phù ban ñầu của mẫu thử ñược tính ở 2 ñộ pha loãng liên tiếp, mỗi ñộ pha loãng gồm 2 ñĩa theo công thức sau: X1 = xd n n C ) . 1 , 0 ( 1+ 2 ∑ Trong ñó:
∑C - tổng số khuẩn lạc trên tất cả các ñĩa ở 2 ñộ pha loãng liên tiếp
ñược ñếm
n1 - số lượng ñĩa ởñộ pha loãng thứ nhất ñược ñếm n2 - số lượng ñĩa ởñộ pha loãng thứ hai ñược ñếm
d - hệ số pha loãng ứng với ñộ pha loãng thứ nhất ñược ñếm.
Kết quảñược làm tròn tới số hàng nghìn và biểu thị dưới dạng tích của một số thập phân hai chữ số (1,0 ….9,9) với 10n (n = số chữ số nguyên của kết quả trừ 1).
3.3.2.3. Phương pháp ñịnh lượng Coliform (theo TCVN 6848:2007)
Chuẩn bị, pha loãng mẫu và ñồng nhất mẫu: các bước tương tự như xác
ñịnh tổng số vi khuẩn hiếu khí.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 24 liên tiếp, mỗi ñộ pha loãng nuối cấy 2 ñĩa, phải dùng pipet riêng trong mỗi ñộ
pha loãng.
Cho vào tâm của mỗi ñĩa petri 1ml dung dịch mẫu thử. Rót 15ml môi trường VRBL ở 440 C ñến 470 C vào mỗi ñĩa Petri. Thời gian từ khi kết thúc khâu chuẩn bị huyền phù ban ñầu ñến thời ñiểm rót môi trường vào ñĩa không vượt quá 15 phút.
Trộn ñều dịch cấy với môi trường ñể cho hỗn hợp ñông ñặc lại bằng cách ñặt ñĩa Petri ở một mặt phẳng ngang, mát.
Sau khi thạch ñã ñông ñặc hoàn toàn, rót khoảng 4 ml môi trường VRBL ở 440 C ñến 470 C lên mặt môi trường nuôi cấy. ðểñông lại như mô tả ở trên.
Lật ngược các ñĩa ñã cấy và ñể vào tủ ấm ở 300C hoặc 370C trong 24h ± 2h.
ðếm các khuẩn lạc: sau thời gian ủ qui ñịnh, chọn các ñĩa Petri có từ 10 khuẩn lạc trở lên ñểñếm khuẩn lạc. Chọn các khuẩn lạc có màu ñỏ ánh tía, có
ñường kính 0,1mm hoặc lớn hơn (ñôi khi có vùng mật tủa hơi ñỏ bao quanh). Các khuẩn lạc này ñược coi là Coliform ñiển hình và không cần phải thử
khẳng ñịnh tiếp.
Khẳng ñịnh: cấy 5 khuẩn lạc của từng loại không ñiển hình, nếu sẵn có, cho vào các ống nghiệm canh thang Lactoza lục sáng. Ủ các ống nghiệm này trong tủ ấm ñặt ở 300C hoặc 370C trong 24h ± 2h. Các ống Durham cho thấy có sinh khí thì ñược coi là có chứa Coliform.
Tính kết quả: Tương tự như xác ñịnh kết quả tổng số vi khuẩn hiếu khí.
3.3.2.3. Phương pháp xác ñịnh số lượng vi khuẩn E.coli có trong thịt theo TCVN 7924-2: 2008
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 25 tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thịt.
Tiến hành nuôi cấy: Cấy 0,1ml dung dịch huyền phù ở các nồng ñộ pha loãng thích hợp lên các ñĩa kép có chứa môi trường TBX (trypton – mật - glucuronid). Các ñĩa này ñược ủ ở 440C ± 10C trong 18h ñến 24h rồi kiểm tra
ñể phát hiện sự có mặt của các khuẩn lạc ñặc trưng ñược coi là E.coli dương tính với β-glucuronidaza.
Tính kết quả: Sau giai ñoạn ủấm theo qui ñịnh, ñếm các CFU ñiển hình của E.coli dương tính với β-glucuronidaza trên mỗi ñĩa thạch chứa ít hơn 150 CFU ñiển hình và ít hơn 300 CFU tổng số (ñiển hình và không ñiển hình). N là số lượng E.coli dương tính với β-glucuronidaza có mặt trong mẫu thử trên mililit sản phẩm từ hai ñộ pha loãng liên tiếp sử dụng công thức.
N= xd n n Vx a ) . 1 , 0 ( 1+ 2 ∑ Trong ñó:
∑ a: là tổng số các khuẩn lạc ñếm ñược trên tất cả các ñĩa ở hai nồng ñộ
pha loãng liên tiếp
n1: là sốñĩa ñược giữ lại ở ñộ pha loãng thứ nhất n2: là sốñĩa ñược giữ lại ở ñộ pha loãng thứ hai
V: thể tích dịch cấy ñã dùng trên mỗi ñĩa, tính bằng mililit
d: hệ số pha loãng tương ứng với ñộ pha loãng thứ nhất ñược giữ lại
3.3.2.4. Phương pháp xác ñịnh số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus: theo TCVN 4830-1: 2005
Chuẩn bị, pha loãng mẫu và ñồng nhất mẫu: tương tự như xác ñịnh tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thịt.
Nuôi cấy: dùng pipet vô trùng chuyển vào hai ñĩa thạch, mỗi ñĩa 0,1ml mẫu thử ở mỗi nồng ñộ pha loãng ñã chọn. Sử dụng dụng cụ dàn mẫu dàn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 26 chất cấy cẩn thận càng nhanh càng tốt, lên mặt ñĩa thạch, cố gắng không chạm vào mép ñĩa. ðể các ñĩa có nắp ñậy cho ñến khô trong khoảng 15 phút ở nhiệt
ñộ phòng thí nghiệm. Lật ngược và ñem ủ các ñĩa trong 24h ± 2h sau ñó ủ
thêm 24h ± 2h trong tủấm ở 350C hoặc 370C.
Sau khi ủ ở 24h ± 2h, ñánh dấu vị trí của các khuẩn lạc ñiển hình có mặt dưới ñáy của các ñĩa. Ủ lại tất cả các ñĩa ở 350C hoặc 370C thêm trong 24h ± 2h và ñánh dấu các khuẩn lạc ñiển hình mới. ðồng thời cũng ñánh dấu cả các khuẩn lạc không ñiển hình có mặt.
Chỉ lấy các ñĩa có chứa tối ña 300 khuẩn lạc với 150 khuẩn lạc ñiển hình hoặc không ñiển hình ở hai dung dịch kế tiếp nhau ñể ñịnh lượng. Một trong các ñĩa phải chứa ít nhất 1 khuẩn lạc. Chọn ñể khẳng ñịnh lượng khuẩn lạc ñã có (thường 5 khuẩn lạc ñiển hình nếu chỉ có khuẩn lạc ñiển hình, hoặc 5 khuẩn lạc không ñiển hình nếu chỉ có khuẩn lạc không ñiển hình, hoặc 5 khuẩn lạc ñiển hình và 5 khuẩn lạc không ñiển hình nếu cả hai loại ñều có mặt
ở mỗi ñĩa).
Khuẩn lạc ñiển hình là các khuẩn lạc có màu ñen, hoặc màu xám, bóng và lồi (có ñường kính từ 1mm ñến 1,5mm sau khi ủ ở 24h và 1,5mm ñến 2,5mm sau khi ủ 48h và ñược bao quanh bởi một vùng trong rõ rệt, cũng có thể mờ từng phần. Sau khi ủ trong ít nhất 24h, có thể xuất hiện một vòng màu trắng ñục tiếp giáp với khuẩn lạc. Các khuẩn lạc không ñiển hình cùng kích cỡ như khuẩn lạc ñiển hình và có thể có một trong các hình thái sau: khuẩn lạc ñen bóng có hoặc không có viền trắng hẹp, không có vùng trong hoặc hầu như không nhìn thấy và không có vòng trắng ñục hoặc rất khó nhìn thấy; các khuẩn lạc màu xám không có vùng trong. Các khuẩn lạc khác là tất cả các khuẩn lạc còn lại có khả năng có mặt trên các ñĩa mà không cho thấy biểu hiện bên ngoài ñiển hình hoặc không ñiển hình nhưñã mô tả.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 27
ðể khẳng ñịnh kết quả, thực hiện phép thử Coagulase. Từ mỗi khuẩn lạc ñiển hình ñã chọn, dùng que cấy vô trùng lấy một phần và chuyển vào ống hoặc lọ ñựng môi trường canh thang não - tim. Ủở 350C hoặc 370C trong 24h ± 2h. Bằng kỹ thuật vô trùng, lấy 0,1ml mỗi dịch cấy vào 0,3 ml huyết tương thỏ ñựng trong các ống hoặc lọ ñựng dung dịch hồng cầu vô trùng và ủ ở
nhiệt ñộ 350C hoặc 370C. Nghiêng ống kiểm tra sự kết dính của huyết tương sau khi ủ từ 4h ñến 6h và nếu phép thử là âm tính, thì kiểm tra lại sau khi ủ
24h, hoặc kiểm tra theo thời gian ủ ñược nhà sản xuất qui ñịnh. Nếu thể tích kết dính chiếm hơn một nửa thể tích ban ñầu của chất lỏng thì phép thử
coagulase là dương tính.
Tính kết quả: chọn các ñĩa có chứa tối ña 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc ñiển hình hoặc không ñiển hình ở hai ñộ pha loãng liên tiếp. Tính số lượng N vi khuẩn Sta.aureus có phản ứng dương tính với coagulase ñược nhận biết trong mẫu thử, là trung bình từ hai ñộ pha loãng liên tiếp bằng công thức sau:
N= xd n n Vx a ) . 1 , 0 ( 1+ 2 ∑ Trong ñó:
∑ a: là tổng số các khuẩn lạc Sta.aureus có phản ứng dương tính với coagulase ñã ñược nhận biết trên tất cả các ñĩa ñã chọn.
n1: là sốñĩa ñược giữ lại ởñộ pha loãng thứ nhất n2:là sốñĩa ñược giữ lại ởñộ pha loãng thứ hai
V: thể tích dịch cấy ñã dùng trên mỗi ñĩa, tính bằng mililit
d: hệ số pha loãng tương ứng với ñộ pha loãng thứ nhất ñược chọn.
3.3.3.5. Phương pháp xác ñịnh vi khuẩn Salmonella (theo ISO:6579-2002)
Phương pháp xác ñịnh sự có mặt của vi khuẩn Salmonella ñược thực hiện theo qui trình sau:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 28 Pha loãng mẫu theo bậc pha loãng thập phân: 10-1, 10-2,…10-4
↓
Tăng sinh chọn lọc:
Cấy 1ml dung dịch pha loãng mẫu nồng ñộ 10-1
sang 10ml môi trường tăng sinh Muller Kauffman, ủở 370C/24h
↓
Phân lập và nhận diện: Cấy 0,1ml dịch tăng sinh
trên 2 môi trường chọn lọc XLT4 và BGA, ủở 370C/24h + Trên môi trường XLT4: Khuẩn lạc ñen bóng, rìa gọn
+ Trên môi trường BGA: Khuẩn lạc màu hồng sáng
↓
Khẳng ñịnh bằng cách thửñặc tính sinh hóa:
- Cấy chuyển sang môi trường TSI: phần thạch nghiêng màu ñỏ, thạch
ñứng màu vàng, sinh H2S, sinh hơi - Thử nghiệm IMVC cho kết quả (- + - +)