polyphenoloxidase (PPO) và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm
Mục đích của thí nghiệm này là xác định hàm lượng ESH, hoạt tính ức chế enzyme PPO và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm chuẩn bị theo quy trình hoàn thiện Hình 2.3.
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích hàm lượng ESH, hoạt tính ức chế enzyme PPO và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm
Phân tích hoạt tính ức chế enzyme PPO Phân tích hàm lượng
ergothioneine
Kết quả phân tích
Thảo luận, đánh giá tiềm năng ứng dụng của dịch chiết nấm rơm vào ngăn chặn biến đen ở tôm sau thu hoạch
Dịch chiết nấm rơm được chuẩn bị theo quy trình hoàn thiện Hình 2.3 Phân tích hoạt tính chống oxy hóa Phân tích tổng năng lực khử Phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH
b) Cách tiến hành thí nghiệm
+ Dịch chiết nấm rơm được chuẩn bị theo quy trình tối ưu theo sơ đồ Hình 2.3 được đem đi phân tích hàm lượng Ergothioniene theo phương pháp của Bao và cộng sự (2008): Cho 1ml methimazole 1mM vào hỗn hợp chứa 0,2 ml dịch chiết nấm rơm; 4,8 ml nước cất và 14 ml ethanol tuyệt đối. Hỗn hợp trên được pha trộn ở 40C trong 2 giờ. Sau đó ly tâm ở 3000g trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Loại bỏ phần
nổi và phần ethanol bốc hơi ở 400C. Phần còn lại hòa tan 10ml nước cất. Hàm lượng
Ergothioneine được phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LCMS- 2010EV. Sử dụng cột C30 (Develosil C30-UG-5, đường kính 4,6 mm, chiều dài cột 250 mm, kích thước hạt 5 µm, Nomura Chemical Co. Ltd.,Aichi, Japan). Sử dụng nước khử ion làm pha động được bơm với tốc độ là 0,25 ml/phút. Thể tích mẫu là
20 ml và nhiệt độ cột được giữ ở 250C. Hàm lượng ERT được xác định bởi các ion
giám sát ERT và IS tại 230 và 115 m/z. Được biểu diễn bằng đường cong hiệu chuẩn thể hiện các nồng độ khác nhau. Tất cả số liệu thu được thể hiện hàm lượng mg ERT thu được trong mỗi ml dịch chiết nấm.
+ Phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002): Cho vào 4 ống nghiệm dịch chiết nấm rơm lần lượt là (0,05 ml; 0,1 ml; 0,15 ml và 0,2 ml) thêm nước cất vào sao cho tổng mỗi ống là 2 ml, lắc đều rồi thêm 1 ml cồn tuyệt đối, lắc đều và thêm 1 ml DPPH 0,1 mM. Sau đó để phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối. Sau 30 phút, hỗn hợp phản ứng được đem đi đo độ hấp phụ tại bước sóng 517 nm trên thiết bị UV-VIS. Mẫu đối chứng được chuẩn bị giống như trên nhưng thay thế dung dich mẫu bằng nước cất.
Khả năng khử gốc tự do được xác định như sau: ACL = AĐC – AM
Trong đó
ACL: Độ hấp phụ còn lại của mẫu tại bước sóng 517 nm.
AĐC: Độ hấp phụ của mẫu đối chứng tại bước sóng 517 nm.
AM: Độ hấp phụ của mẫu tại bước sóng 517
Dựa trên đồ thị đường chuẩn DPPH để xác định nồng độ còn lại của DPPH Nồng độ DPPH bị khử được tính bằng công thức sau:
Nồng độ DPPH bị khử = Nồng độ DPPH đối chứng – Nồng độ DPPH còn lại
*Đồ thị đường chuẩn DPPH
Hình 2.8. Đồ thị đường chuẩn DPPH
+ Phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử theo phương pháp của Oyaizu (1986): Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống với các thể tích (0,05ml;
0,15ml; 0,1ml; 0,2ml) dịch chiết nấm rơm. Sau đó cho 0,5ml K3[Fe(CN)6] 1% vào
mỗi ống và thêm dung dịch đệm phosphat (pH=6,8) sao cho tổng số là 1,5ml, lắc đều rồi đem đi ủ trong tủ ấm ở 50oC trong 20 phút. Lấy ra thêm vào 0,5ml tricloacetic 0,1% , 2ml nước cất và 0,4ml FeCl3 0,1% rồi lắc đều và đem đi đo ở bước sóng 700nm trên máy quang phổ kế.
+ Phân tích hoạt tính ức chế enzyme PPO : Cho 1 ml dịch chiết nấm rơm vào hệ phản ứng bao gồm 0,1 ml catechol 500 mM; 0,1 ml L-Proline 500 mM; 2,9 ml đệm phosphate (pH 6,8) 50 mM và 0,1 ml dung dich enzyme polyphenoloxydase có chứa 100 đơn vị hoạt độ/mL. Ở mẫu đối chứng 1 ml dung dịch mẫu được thay bằng dung dịch đệm phosphate. Hỗn hợp phản ứng được đưa đi đo liên tục trong
600 giây ở bước sóng hấp thụ 530 nm (A530) trên thiết bị UV-VIS. Hoạt tính ức chế
hoạt động enzyme polyphenoloxydase được tính theo công thức sau đây: Hoạt tính ức chế hoạt (%) = 100 - [(A x 100) / B]
B = Độ hấp thụ của mẫu đối chứng (không có dịch chiết nấm rơm) ở bước sóng 530 nm