2.1.1. Nấm rơm:
Nấm rơm được sử dụng trong nghiên cứu này thuộc:
Ngành: Basidiomycota Lớp: Agaricomycetes Bộ: Agaricales Họ: Pluteaceae Giống: Volvariella Loài: V. volvacea
Tên tiếng anh là Straw mushroom
Nấm rơm được mua ở trang trại nấm của ông Hoàng Văn Thuận, xã Cam Hiệp, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa. Nấm rơm vừa mới thu hoạch, còn tươi nguyên, không bị dập nát, tổn thương. Nấm rơm được cho vào túi PE và bảo quản trong thùng xốp để vận chuyển về phòng thí nghiệm.
2.1.2 Tôm nguyên liệu:
Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) dùng trong nghiên cứu này được
mua tại ao nuôi của ông Trần Tiến ở tổ dân phố Hà Liên, phường Ninh Hà, thị xã Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa. Tôm được nuôi công nghiệp với diện tích 5000m2. Được vận chuyển sống trong thùng xốp có sục khí về phòng thí nghiệm. Kích cỡ tôm từ 90-100 con/kg, không dùng tôm bị thương hoặc tôm bệnh.
Hình 2.2. Tôm thẻ chân trắng (P. vannamei)
2.2. Hóa chất:
Các hóa chất sử dụng cho nghiên cứu này bao gồm: Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O, cồn 90O, FeCl3.6H2O, methanol, acid acetic và được sản xuất bởi công ty Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd. DPPH được mua của
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Tất cả các hóa chất đều có độ tinh khiết trên 99%.
Các hóa chất trên đều đạt tiêu chuẩn sử dụng trong phòng thí nghiệm.
2.3. Máy và thiết bị:
- Hệ thống phân tích hình ảnh gồm: Camera kỹ thuật số Panasonic DMC 10 Mp, buồng chụp hình (không có ánh bên ngoài chiếu vào, được lắp 04 đèn huỳnh quang ở 04 đỉnh của buồng), laptop có phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ (Phần mềm này được cung cấp miễn phí bởi Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ, Bethesda, MD).
+ Máy quang phổ UV-1600PC SHIMADZU + Máy sắc ký LCMS-2010EV SHIMADZU
2.4. Phương pháp nghiên cứu:
2.4.1. Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm chống oxy hóa từ nấm rơm
Mục đích của thí nghiệm này là xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết nấm rơm. Theo nghiên cứu Ilgaz Akata và cộng sự (2012) cho thấy thành
phần hóa học của nấm kim châm (F. Velutipes) trong 100g nấm khô như sau: Hàm
lượng ẩm: 9,84%; Tro: 10,40%; Protein: 22,04%; Chất béo: 7,33%; Carbohydrates:
50,40% [36]. Trong khi đó thành phần hóa học của nấm rơm (V. volvacea ) trong
100g nấm khô như sau: Hàm lượng ẩm: 9,36%; Tro: 10,00%; Protein: 28,04%; Chất béo: 3,33%; Carbohydrates: 50,31% [9]. Thành phần hóa học của hai loại nấm tương tự nhau. Vì vậy nghiên cứu này, các công đoạn chính của quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm đề xuất dựa vào quy trình chiết tách chất chống oxy
hóa từ nấm kim châm (F. Velutipes) của Bao và cộng sự (2009) [12].
Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm được trình bày trên sơ đồ hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa:
- Khả năng khử gốc tự do DPPH - Tổng năng lực khử
- Thời gian chiết - Nhiệt độ chiết - Tỷ lệ nấm/nước Nấm rơm Lọc Dịch chiết Rửa Xay nhỏ Chiết Phân tích số liệu Chọn chế độ chiết tách thích hợp
2.4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm của dịch chiết nấm rơm
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm
b) Cách tiến hành: Nấm rơm (2 kg) sau khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm được rửa sạch để loại bỏ các tạp chất. Sau đó, lấy mỗi mẫu 100g nấm đã được xay nhỏ cho vào trong 1000 ml nước và cố định thời gian chiết là 60 phút. Theo nghiên cứu Bao và cộng sự (2009) nhiệt độ chiết tối ưu đối với nấm kim châm
là 95OC. Do đó, nghiên cứu này đã chọn khảo sát nhiệt độ chiết ở 3 mốc là: 90OC,
95OC và 100OC. Dịch chiết nấm rơm thu được ở trên được điều chỉnh về cùng thể
Điều chỉnh thể tích
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa:
- Khả năng khử gốc tự do DPPH - Tổng năng lực khử
Lọc
Dịch chiết
Phân tích số liệu chọn nhiệt độ chiết thích hợp
90 95 100 Nấm rơm Rửa Xay nhỏ Chiết - Thời gian: 60 phút - Tỷ lệ nấm/nước: 1/10 - Nhiệt độ (OC)
tích là 1000 ml và đem đi phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử để chọn nhiệt độ thích hợp. Thí nghiệm trên được tiến hành lặp lại 3 lần.
2.4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm dịch chiết nấm rơm
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm
b) Cách tiến hành: Nấm rơm (2kg) sau khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm được rửa sạch để loại bỏ các tạp chất. Sau đó, lấy mỗi mẫu 100g nấm đã
được cắt nhỏ cho vào trong 1000 ml nước và cố định nhiệt độ chiết là 95OC. Theo
nghiên cứu Bao và cộng sự (2009) thời gian chiết tối ưu đối với nấm kim châm là 60 phút. Do đó, nghiên cứu này đã chọn khảo sát thời gian chiết ở 3 mốc là: 30
Điều chỉnh thể tích
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa:
- Khả năng khử gốc tự do DPPH - Tổng năng lực khử
Lọc
Dịch chiết
Phân tích số liệu chọn nhiệt độ chiết thích hợp
30 60 90 Nấm rơm Rửa Xay nhỏ Chiết - Nhiệt độ: 95OC - Tỷ lệ nấm/nước: 1/10 - Thời gian (Phút)
phút, 60 phút và 90 phút. Dịch chiết nấm rơm thu được ở trên được điều chỉnh về cùng thể tích là 1000 ml và đem đi phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử để chọn nhiệt độ thích hợp. Thí nghiệm trên được tiến hành lặp lại 3 lần.
2.4.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm của dịch chiết nấm rơm
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính chống oxy hóa của chiết nấm rơm
b) Cách tiến hành: Nấm rơm (2kg) sau khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm được rửa sạch để loại bỏ các tạp chất. Sau đó, lấy mỗi mẫu cố định nhiệt độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chiết là 95OC và thời gian chiết là 60 phút. Theo nghiên cứu Bao và cộng sự (2009)
Điều chỉnh thể tích
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa:
- Khả năng khử gốc tự do DPPH - Tổng năng lực khử
Lọc
Dịch chiết
Phân tích số liệu chọn nhiệt độ chiết thích hợp
1/8 1/10 1/12 Nấm rơm Rửa Xay nhỏ Chiết - Nhiệt độ: 95OC - Thời gian: 60 Phút - Tỷ lệ nấm/nước
tỷ lệ chiết nấm/nước tối ưu đối với nấm kim châm là 1/10. Do đó, nghiên cứu này đã chọn khảo sát tỷ lệ chiết nấm/nước ở 3 mốc là: 1/12, 1/10 và 1/8. Dịch chiết nấm rơm thu được ở trên được điều chỉnh về cùng thể tích là 1000 ml và đem đi phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử để chọn nhiệt độ thích hợp. Thí nghiệm trên được tiến hành lặp lại 3 lần.
2.4.2. Phân tích hàm lượng ergothioneine (ESH), hoạt tính ức chế enzyme polyphenoloxidase (PPO) và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm polyphenoloxidase (PPO) và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm
Mục đích của thí nghiệm này là xác định hàm lượng ESH, hoạt tính ức chế enzyme PPO và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm chuẩn bị theo quy trình hoàn thiện Hình 2.3.
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích hàm lượng ESH, hoạt tính ức chế enzyme PPO và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm
Phân tích hoạt tính ức chế enzyme PPO Phân tích hàm lượng
ergothioneine
Kết quả phân tích
Thảo luận, đánh giá tiềm năng ứng dụng của dịch chiết nấm rơm vào ngăn chặn biến đen ở tôm sau thu hoạch
Dịch chiết nấm rơm được chuẩn bị theo quy trình hoàn thiện Hình 2.3 Phân tích hoạt tính chống oxy hóa Phân tích tổng năng lực khử Phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH
b) Cách tiến hành thí nghiệm
+ Dịch chiết nấm rơm được chuẩn bị theo quy trình tối ưu theo sơ đồ Hình 2.3 được đem đi phân tích hàm lượng Ergothioniene theo phương pháp của Bao và cộng sự (2008): Cho 1ml methimazole 1mM vào hỗn hợp chứa 0,2 ml dịch chiết nấm rơm; 4,8 ml nước cất và 14 ml ethanol tuyệt đối. Hỗn hợp trên được pha trộn ở 40C trong 2 giờ. Sau đó ly tâm ở 3000g trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Loại bỏ phần
nổi và phần ethanol bốc hơi ở 400C. Phần còn lại hòa tan 10ml nước cất. Hàm lượng
Ergothioneine được phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LCMS- 2010EV. Sử dụng cột C30 (Develosil C30-UG-5, đường kính 4,6 mm, chiều dài cột 250 mm, kích thước hạt 5 µm, Nomura Chemical Co. Ltd.,Aichi, Japan). Sử dụng nước khử ion làm pha động được bơm với tốc độ là 0,25 ml/phút. Thể tích mẫu là
20 ml và nhiệt độ cột được giữ ở 250C. Hàm lượng ERT được xác định bởi các ion
giám sát ERT và IS tại 230 và 115 m/z. Được biểu diễn bằng đường cong hiệu chuẩn thể hiện các nồng độ khác nhau. Tất cả số liệu thu được thể hiện hàm lượng mg ERT thu được trong mỗi ml dịch chiết nấm.
+ Phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002): Cho vào 4 ống nghiệm dịch chiết nấm rơm lần lượt là (0,05 ml; 0,1 ml; 0,15 ml và 0,2 ml) thêm nước cất vào sao cho tổng mỗi ống là 2 ml, lắc đều rồi thêm 1 ml cồn tuyệt đối, lắc đều và thêm 1 ml DPPH 0,1 mM. Sau đó để phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối. Sau 30 phút, hỗn hợp phản ứng được đem đi đo độ hấp phụ tại bước sóng 517 nm trên thiết bị UV-VIS. Mẫu đối chứng được chuẩn bị giống như trên nhưng thay thế dung dich mẫu bằng nước cất.
Khả năng khử gốc tự do được xác định như sau: ACL = AĐC – AM
Trong đó
ACL: Độ hấp phụ còn lại của mẫu tại bước sóng 517 nm.
AĐC: Độ hấp phụ của mẫu đối chứng tại bước sóng 517 nm.
AM: Độ hấp phụ của mẫu tại bước sóng 517 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dựa trên đồ thị đường chuẩn DPPH để xác định nồng độ còn lại của DPPH Nồng độ DPPH bị khử được tính bằng công thức sau:
Nồng độ DPPH bị khử = Nồng độ DPPH đối chứng – Nồng độ DPPH còn lại
*Đồ thị đường chuẩn DPPH
Hình 2.8. Đồ thị đường chuẩn DPPH
+ Phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử theo phương pháp của Oyaizu (1986): Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống với các thể tích (0,05ml;
0,15ml; 0,1ml; 0,2ml) dịch chiết nấm rơm. Sau đó cho 0,5ml K3[Fe(CN)6] 1% vào
mỗi ống và thêm dung dịch đệm phosphat (pH=6,8) sao cho tổng số là 1,5ml, lắc đều rồi đem đi ủ trong tủ ấm ở 50oC trong 20 phút. Lấy ra thêm vào 0,5ml tricloacetic 0,1% , 2ml nước cất và 0,4ml FeCl3 0,1% rồi lắc đều và đem đi đo ở bước sóng 700nm trên máy quang phổ kế.
+ Phân tích hoạt tính ức chế enzyme PPO : Cho 1 ml dịch chiết nấm rơm vào hệ phản ứng bao gồm 0,1 ml catechol 500 mM; 0,1 ml L-Proline 500 mM; 2,9 ml đệm phosphate (pH 6,8) 50 mM và 0,1 ml dung dich enzyme polyphenoloxydase có chứa 100 đơn vị hoạt độ/mL. Ở mẫu đối chứng 1 ml dung dịch mẫu được thay bằng dung dịch đệm phosphate. Hỗn hợp phản ứng được đưa đi đo liên tục trong
600 giây ở bước sóng hấp thụ 530 nm (A530) trên thiết bị UV-VIS. Hoạt tính ức chế
hoạt động enzyme polyphenoloxydase được tính theo công thức sau đây: Hoạt tính ức chế hoạt (%) = 100 - [(A x 100) / B]
B = Độ hấp thụ của mẫu đối chứng (không có dịch chiết nấm rơm) ở bước sóng 530 nm
2.4.3. Thử nghiệm khả năng ngăn chặn biến đen của dịch chiết nấm rơm trên tôm thẻ chân trắng tôm thẻ chân trắng
Mục đích của thí nghiệm này nhằm tìm ra chế độ xử lý thích hợp đế làm chậm thời gian biến đen trên tôm thẻ chân trắng.
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khả năng ngăn chặn biến đen của dịch chiết nấm rơm trên tôm thẻ chân trắng
Mẫu xử lý
Giết chết bằng hỗn hợp nước và nước đá ở 0 – 2OC
Tôm thẻ chân trắng còn sống Nhúng qua dịch chiết nấm rơm pha loãng 2 lần Mẫu đối chứng (Không nhúng qua dịch chiết nấm rơm) Nhúng qua dịch chiết nấm rơm pha loãng 1,5 lần Nhúng qua dịch chiết nấm rơm không pha loãng
Phân tích kết quả đánh giá
Bảo quản bằng nước đá trong thùng cách nhiệt duy nhì nhiệt độ bảo quản từ 0-5OC
Hàng ngày lấy mẫu đánh giá, phân tích các chỉ tiêu sau:
- Đo màu sắc bằng phương pháp phân tích hình ảnh
- Đánh giá cảm quan biến đen
- Đánh giá cảm quan chất lượng
Thảo luận, đề xuất chế độ xử lý thích hợp để ngăn chặn sự biến đen ở tôm bằng dịch chiết nấm rơm
5 phút 10 phút 15 phút 5 phút 10 phút 15 phút 5 phút 10 phút 15 phút
b) Cách tiến hành thí nghiệm
Tôm sau khi đánh bắt, loại bỏ rác bẩn và được vận chuyển sống về phòng thí nghiệm, sau đó được giết chết bằng cách nhúng vào hỗn hợp nước và nước đá ở
nhiệt độ 0 – 2OC trong vòng 15 phút. Tôm sau khi giết chết được vớt ra chia ngẫu
nhiên thành các mẫu nhỏ 10 con/mẫu để làm thí nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm dịch chiết nấm rơm đến sự biến đen của tôm trong quá trình bảo quản bằng nước đá, các mẫu thí nghiệm được nhúng qua dịch chiết nấm rơm không pha loãng, pha loãng 1,5 lần và pha loãng 2 lần (so với dịch chiết ban đầu) trong các khoảng thời gian: 5, 10, 15 phút. Dịch chiết nấm rơm đã được làm lạnh đến nhiệt độ 2-4OC trước khi nhúng
tôm vào. Mẫu đối chứng không nhúng qua dịch chiết nấm rơm.
Sau đó, các mẫu được đem đi bảo quản trong thùng cách nhiệt. Kiểm tra và bổ sung nước đá 3 lần/ngày để duy trì nhiệt độ bảo quản cho tôm. Hàng ngày, tiến hành lấy mẫu đánh giá và phân tích cảm quan về biến đen, chất lượng và đo màu sắc của tôm để phân tích.
Các kết quả thu được ở trên được phân tích, đánh giá và đề xuất chế độ xử lý thích hợp để làm chậm thời gian biến đen trên tôm thẻ chân trắng.
Thí nghiệm này được lặp lại 3 lần.
2.4.4. Các phương pháp phân tích
- Phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) và tổng năng lực khử theo phương pháp của Oyaizu (1986). Hai phương pháp này được trình bày chi tiết ở Phụ lục 1 và Phụ lục 2.
- Phân tích hàm lượng ergothioneine theo phương pháp của Bao và cộng sự (2008), được trình bày chi tiết ở Phụ lục 3.
- Phân tích hoạt tính ức chế enzyme polyphenoloxydase theo phương pháp của Jang và cộng sự (2004), được trình bày chi tiết ở Phụ lục 4.
- Đo màu sắc của tôm bằng phương pháp phân tích hình ảnh theo Encarnacion và cộng sự (2010), được trình bày chi tiết ở Phụ lục 5.
- Đánh giá cảm quan sự biến đen ở tôm theo phương pháp cho điểm của Otwell và Marshall (1986). Thang điểm đánh giá cảm quan được mô tả chi tiết ở Phụ lục 6.
- Đánh giá cảm quan chất lượng ở tôm theo nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng (1999). Thang điểm đánh giá cảm quan được mô tả chi tiết ở Phụ lục 7.