Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa số khuẩn lạc và độ đục bằng
phương pháp đếm khuẩn lạc:
Nguyên tắc:
Đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi khuẩn lạc hình thành từ 1 tế bào duy nhất.
Khi một pha lỏng có chứa nhiều cấu tử không tan thì sẽ hình thành 1 hệ huyền phù và có độ đục gây ra bởi các cấu tử hiện diện trong môi trường lỏng làm cản trở ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục.
Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tuyến tính giữa mật độ tế
45
bào và độ đục. Do đó có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua độ đục bằng máy so màu.
Tiến hành:
Nuôi cấy giống vi khuẩn và thu dịch ở những thời điểm khác nhau. Sau đó pha loãng dịch huyền phù tế bào khác nhau sao cho khi đo độ đục, dịch huyền phù vi khuẩn có giá trị OD610 nằm trong khoảng 0,05 đến 0,25. Mẫu trắng là môi trường chưa nuôi cấy.
Hút 1 ml dịch huyền phù ở từng độ pha loãng với OD khác nhau, tiếp tục pha loãng thành các dãy nồng độ khác nhau theo hệ số thập phân. Hút 0,1ml huyền phù cho vào đĩa petri chứa môi trường MRS thạch và trãi đều ( mỗi nồng độ pha loãng cấy 3 đĩa)
Đặt các đĩa vào tủ ủ kỵ khí ở 37 oC trong 48h Đếm khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri
Ghi nhận các nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc 30-300 khuẩn lạc/ đĩa. Nhân số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa với hệ số pha loãng, tính giá trị trung bình số khuẩn lạc từ 1ml mẫu:
Số tế bào/ml mẫu = n * D / V
n: số khuẩn lạc trung bình trong một đĩa ở một nồng độ pha loãng nhất định V: thể tích dịch mẫu đem cấy ( 0,1ml)
D:hệ số pha loãng.
Dựng đường tương quan tuyến tính giữa CFU/ml trên trục tung và OD610
trên trục hoành.
Xây dựng đường cong sinh trưởng:
Nguyên tắc:
Sự tăng sinh của vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong quần thể. Tốc độ tăng trưởng là sự tăng sinh của vi sinh vật trong một đơn vi thời gian.
Trong thực nghiệm, khi một chủng được cấy vào môi trường mới, chủng này sẽ thể hiện một đường cong tăng trưởng đặc trưng.
46
Ở khoảng giá trị nhất định, mật độ của tế bào trong môi trường nuôi cấy tỷ lệ với độ đục. Do đó có thể sử dụng phương pháp đo độ đục để đánh giá sự tăng trưởng của chủng trong môi trường nuôi cấy bằng máy so màu nhằm theo dõi sự gia tăng của mật độ tế bào và xây dựng đường cong sinh trưởng của chúng.
Tiến hành:
Dùng pipetman với đầu típ vô trùng hút mẫu ở erlen sau mỗi 2 giờ nuôi cấy
đem đo OD610. Mẫu trắng là môi trường chưa nuôi cấy.
Từ giá trị OD610 dựa vào đường tương quan tuyến tính giữa số tế bào vi khuẩn và độ hấp thu, tính được số khuẩn lạc/ml tương ứng.
47
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN