Các chủng vi khuẩn phân lập từ đường tiêu hóa heo được tiến hành nghiên cứu in vitro nhằm sàng lọc một số chủng có tiềm năng làm probiotic. Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic phải chịu sự tác động đồng thời hay liên tiếp các điều kiện bất lợi như sốc nhiệt nhẹ (nhiệt độ cơ thể), tính acid của dịch dạ dày, các enzyme trong dịch tụy, lysozyme và muối mật (Klaenhammer và Kullen, 1999). Vì những lý do nêu trên, nghiên cứu này đã được tiến hành nhằm bước đầu sàng lọc các chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotic ở mức độ in vitro, thể hiện qua khả năng tồn tại trong điều kiện tương tự đường tiêu hóa của lợn khi xử lý bằng pH thấp, enzyme pepsine, pancreatine và muối mật và khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột như E.coli, Bacillus cereus,…
3.3.6.1 Khảo sát khảnăng sống trong môi trường có pH thấp
Nguyên tắc:
Các chủng vi khuẩn phân lập được sẽ được xử lý bởi dung dịch pH thấp tương tự như pH của môi trường dạ dày. Theo nghiên cứu của Zhou và cs (2007),
43
cho rằng giá trị pH2 và pH3 được xem là giới hạn quyết định trong sàng lọc các chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotic. Thời gian xử lý cũng mô phỏng theo thời gian thức ăn lưu trong dạ dày.
Tiến hành:
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy qua đêm trên môi trường MRS broth. Ly tâm 1ml dịch nuôi cấy, thu sinh khối. Rửa tế bào bằng 1ml dung dịch NaCl 0,85% (pH 7,2).
Tái huyền phù trong các ống nghiệm đựng 9ml dung dịch PBS (Phosphate Buffered Saline) pH1, pH2 và pH3.
Sau khi ủ ở 370C trong các khoảng thời gian 0, 60 và 120 phút, các chủng vi sinh vật được cấy gạt trên môi trường MRS agar.
Nuôi ủ ở 370C.
Sau 24 đến 48 giờ, xác định số lượng khuẩn lạc trên các đĩa petri.
3.3.6.2 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật
Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật thử nghiệm đối với các chủng vi khuẩn kiểm định (Bacillus sp.) được xác định theo phương pháp của De Angelis và cs (2006), Aslim và cs (2006).
Nguyên tắc:
Thực hiện theo nguyên tắc khuyếch tán trên đĩa thạch, phương pháp này dựa trên khả năng kháng các vi sinh vật chỉ thị của các vi sinh vật kiểm định.
Tiến hành:
Vi sinh vật được nuôi cấy qua đêm (khoảng 16 18 giờ) trong môi trường lỏng trên máy lắc để đạt mật độ tế bào là 108 CFU/ml. Sau đó, dung dịch tế bào vi khuẩn nuôi cấy được ly tâm để loại bỏ hoàn toàn tế bào vi khuẩn.
Các chủng vi sinh vật kiểm định (B. sutilis) được nuôi đến nồng độ 109 CFU/ml được cấy trải trên các đĩa môi trường NA agar với thể tích 20 µl.
Sau đó, sử dụng các ống thép đã được vô trùng khoan các lỗ đường kính 5
mm trên các đĩa thạch. Dịch lọc của từng chủng vi sinh vật thử nghiệm được cho vào vào các lỗ thạch với thể tích 35 µl. Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở 37°C. Khả
44
năng kháng B. sbtilis của các chủng vi sinh vật thử nghiệm được xác định dựa vào
đường kính vòng vô khuẩn xuất hiện xung quanh lỗ thạch.