3.3.3.1 Quan sát đại thể
Nguyên tắc:
Quan sát và mô tả hình dạng kích thước và màu sắc khuẩn lạc của các chủng phân lập được. Tiến hành quan sát kính hiển vi các chủng để xác định hình dạng tế bào, khả năng di động và khả năng bắt màu qua phương pháp nhuộm Gram đối với các chủng vi khuẩn.
Tiến hành:
Quan sát đặc điểm hình dạng khuẩn lạc: Sử dụng phương pháp cấy ria các chủng vi sinh vật trên các môi trường thạch đĩa tương ứng. Các chủng vừa mới phân lập được quan sát trên môi trường MRS ủ trong điều kiện 37°C, 24 đến 48 giờ
3.3.3.2 Quan sát vi thể bằng phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc:
Đây là phương pháp giúp phân biệt vi khuẩn nhờ đặc điểm hình thái, sự sắp xếp tế bào và lớp vỏ tế bào. Theo phương pháp này, tế bào vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dày sẽ bắt màu tím, còn vi khuẩn Gram âm có ít lớp peptidoglycan sẽ bắt màu hồng. Từ đó chúng ta có thể xác định tính chất Gram cùng với sự sắp xếp theo dạng chuỗi hay không và cả vị trí hình dạng bào tử của chủng vi khuẩn.
40
Nhỏ giọt nước lên tấm phiến sạch. Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính để cố định mẫu.
Phủ mẫu với thuốc nhuộm crystal violet từ 1 - 2 phút rồi rửa bằng nước. Phủ mẫu với dung dịch Gram iodine khoảng 30 giây rồi rửa nhẹ với nước
Tẩy cồn 96o khoảng 15 giây, sau đó rửa nước.
Cuối cùng, phủ mẫu với thuốc nhuộm fuchsin trong 30 giây rồi rửa nước. Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Sau đó, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu 100. Ghi nhận hình dạng tế bào, khả năng bắt màu thuốc nhuộm Gram.
3.3.3.3 Xác định Gram
Thực hiện phản ứng “string test” với KOH 3%.
Trộn đều sinh khối vi khuẩn trong giọt KOH 3% trên phiến kính, phản ứng kéo dài trong 60 giây, nếu có hiện tượng kéo sợi thì đó là trắc nghiệm (+) và vi khuẩn Gram (-) do màng vi khuẩn bị phá vỡ. Ngược lại, không thấy hiện tượng kéo sợi là trắc nghiệm (-) và vi khuẩn Gram (+) do KOH không tác động lên màng tế bào vi khuẩn.
Thử nghiệm với đối chứng là vi khuẩn E.coli Gram(-).