- Các mẫu nấm ký sinh rầy nâu thu thập trên ựồng ruộng ở một số tỉnh thuộc đồng bằng Bắc Bộ (Hà Nội, Hải Phòng, Vĩnh Phúc)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. điều tra thu thập, phân lập và xác ựịnh nguồn nấm Paecilomyces có khả năng ký sinh gây chết cao ựối rầy nâu hại lúa khả năng ký sinh gây chết cao ựối rầy nâu hại lúa
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 điều tra thu thập mẫu nấm ký sinh tự nhiên trên rầy nâu hại ngoài ựồng ruộng tại 3 tỉnh thuộc ựồng Bằng Bắc Bộ là Vĩnh Phúc, Hà Nội, Hải Phòng theo phương pháp ựiều tra tác nhân sinh học có ắch ngoài tự nhiên của Viện BVTV[24]. để thu thập ựược số lượng lớn mẫu nấm ký sinh, ựề tài tiến hành tập trung ựiều tra tại các ruộng lúa có mật ựộ rầy cao, tại thời ựiểm tháng 9, tháng 10 của vụ mùa và vào tháng 5, tháng 6 của vụ xuân. Các mẫu nấm ký sinh rầy thu ngoài ựồng ruộng ựược bảo quản trong ống tuýp rồi chuyển về phòng thắ nghiệm. Sau ựó tiến hành ựể ẩm trong ựĩa petri cho nấm mọc tiếp, sau 12- 24 giờ tiến hành chọn lọc, phân loại mẫu.
+ Phân lập, tạo dòng thuần các nguồn nấm ựã thu thập ựược
Phân lập, làm chủng thuần các nguồn nấm ký sinh rầy hại lúa theo phương pháp nghiên cứu vi sinh thường áp dụng tại Việt nam [5,14,18].
Bước 1: Nấu môi trường PDA với thành phần 200g khoai tây, 20g Agar và 5g ựường Dextrose trong 1000ml nước (khoai tây thái lát ựun sôi ở 1000C trong thời gian 20 phút và lọc lấy dịch chiết sau ựó cho agar và ựường vào). Khử trùng môi trường PDA trong nhiệt ựộ 1210C (áp xuất 1 atm) trong thời gian 30 phút, sau ựó ựể nguội khoảng 55oC và bổ xung kháng sinh streptomycin 0,1%. đổ môi trường ra ựĩa petri (ựã ựược sấy khử trùng ở 150oC trong 2,5 giờ) và ựể nguội.
Bước 2: Cấy phân lập mẫu nấm: Tiến hành vệ sinh mẫu nấm kắ sinh, dùng que cấy ựã khử trùng trên ngọn lửa ựèn cồn, sau ựó làm nguội và chấm nhẹ vào ựiểm có bào tử ựặc trưng của các nguồn nấm ký sinh trên cơ thể rầy và không bị nhiễm tạp sau ựó cấy ria nhẹ lên bề mặt môi trường. để ựĩa môi trường cấy phân lập trong phòng thắ nghiệm 2-3 ngày, thấy khuẩn lạc ựặc trưng của nấm xuất hiện thì tiến hành cấy tách ra các ựĩa môi trường khác nhau ựể làm thuần chủng.
+ đánh giá khả năng ký sinh gây chết ựối với rầy nâu của các dòng nấm ựã phân lập ựược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 Thắ nghiệm ựánh giá khả năng ký sinh gây chết rầy của các dòng nấm ký sinh trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm ựược bố trắ 5 công thức, mỗi công thức tương ứng với một dòng nấm ựã phân lập ựược:
CT 1: Nấm xanh lục Metarhizium anisopliae ( MaR)
CT 2: Nấm xanh nhạt: Metarhizium flavoviride (MfR)
CT 3: Nấm tắm xám: Paecilomyces sp. (PaeR)
CT 4: Nấm trắng vôi: Beauveria bassiana (BbR)
CT 5: đối chứng phun nước lã
Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại thử nghiệm 30 cá thể rầy nâu tuổi 2-3/1khóm lúa/1lồng mica (ựặt trong phòng thắ nghiệm). Rầy nâu thử nghiệm ựược lấy từ nguồn nuôi trong nhà lưới của Viện BVTV.
+ Phương pháp tách ựơn bào tử tạo dòng thuần nấm Paecilomyces sp.
Tạo dòng nấm thuần bằng phương pháp tách ựơn bào tử trên ựĩa thạch WA. Bằng cách dùng que cấy thuỷ tinh chấm nhẹ vào bề mặt khuẩn lạc, rồi cấy vào ựĩa thạch môi trường WA. Sau ựó dùng trang thuỷ tinh trang ựều ra bề mặt ựĩa thạch và ựể ựĩa thạch ựó trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm. Sau khoảng 12 - 24 giờ tiến hành soi ựĩa nấm ựó bằng kắnh lúp ựể bàn ựể sát bào tử nấm nảy mầm. Khi thấy bào tử nảy mầm, dùng que cấy có ựầu nhọn hình lưỡi mác cắt riêng phần thạch chứa bào tử ựó cấy sang ựĩa môi trường khác, sau ựó ựể ựĩa có chứa ựơn bào tử ựó trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm.
+ Tuyển chọn dòng nấm Paecilomyces sp. có hiệu lực gây chết cao ựối với rầy nâu trong ựiều kiện nhà lưới
Thắ nghiệm bố trắ với 6 công thức (CT), mỗi công thức tương ứng mỗi dòng nấm Paecilomyces sp. và ựối chứng phun nước lã.
CT1: Dòng nấm PaeR1 ký sinh trên rầy nâu, thu thập tại Hà Nội CT2: Dòng nấm PaeR3 ký sinh trên rầy lưng trắng, thu thập tại Hà Nội CT3: Dòng nấm PaeR4 ký sinh trên rầy nâu nhỏ, thu thập tại Hà Nội
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 CT4: Dòng nấm PaeR5 ký sinh trên rầy nâu, thu thập tại Hải Phòng CT5: Dòng nấm PaeR6 ký sinh trên rầy nâu, thu thập tại Vĩnh Phúc CT6: đối chứng: Phun nước lã
Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại thử nghiệm 30 cá thể rầy nâu tuổi 2- 3/1khóm lúa/1lồng mica (ựặt trong phòng thắ nghiệm). Rầy nâu thử nghiệm ựược lấy từ nguồn nuôi trong nhà lưới của Viện BVTV.
+ định danh ựến loài dòng nấm Paecilomyces sp. (PaeR1) có hiệu lực ký sinh gây chết rầy nâu cao
định danh các chủng nấm ựến loài trên cơ sở quan sát các ựặc ựiểm hình thái phân loại của các nguồn nấm như: triệu trứng ký sinh, khuẩn lạc, cành bào tử và bào tử, v.v. so sánh với tài liệu phân loại của Barnet H. L. (1960) [27] và Samson R. A. (1974, 1988, 2004) [56; 54; 55], Liang Z. Q. (2005) [46], Keith Seifert (2011)[43] và tài liệu phân loại trực tuyến trên MycoBank [66].
để ựịnh danh chắnh xác loài Paecilomyces sp.ựề tài phối hợp với Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học, thuộc đại học Quốc gia Hà Nội tiến hành phân loại hình thái của nấm kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen rARN 28S ựoạn D1/D2 và ựoạn ADNr- ITS của dòng nấm PaeR1, sau ựó so sánh trên ngân hàng gen NBCI ựể ựịnh loài.