Cấu tạo của cột Silicagel đa lớp sử dụng:
1 0 . 0 0 1 1 . 0 0 1 2 . 0 0 1 3 . 0 0 1 4 . 0 0 1 5 . 0 0 1 6 . 0 0 1 7 . 0 0 1 8 . 0 0 5 8 6 0 6 2 6 4 6 6 6 8 7 0 7 2 7 4 7 6 7 8 8 0 8 2 8 4 8 6 8 8 9 0 9 2 9 4 T i m e - - > A b u n d a n c e T IC : D IO X IN H U N G 2 5 0 2 0 8 0 2 .D \ d a ta s i m .m s T IC : D IO XI N M2 . 4 8 h 2 0 0 2 0 8 0 2 . D \ d a t a s i m . m s
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Hỡnh 3.12: Cấu tạo của cột Silicagel đa lớp của hóng Supelco
Tiến hành thực nghiệm nhƣ sau:
Hoạt húa cột bằng cỏch cho 200ml n - hexan qua cột với lƣu lƣợng cỡ 3ml/phỳt và luụn giữ lại lớp n-hexan cao hơn bề mặt của pha tĩnh (khụng để pha tĩnh bị khụ). Sau khi hoạt húa, cột silicagel đa lớp đó sẵn sàng để sử dụng.
Phõn tớch chất chuẩn cú nồng độ 100pg/àl 2,3,7,8 – TCDD trờn mỏy (ký hiệu MCOT1).
Lấy 1ml chất chuẩn cú nồng độ 100pg/àl 2,3,7,8 – TCDD cho qua cột, cho thờm 100ml n-hexane để rửa dịch chiết qua cột với tốc độ 1-1,5ml/phỳt và thu hỗn hợp ra khỏi cột cho vào bỡnh, cụ đặc đến 1ml, sau đú phõn tớch trờn mỏy (Ký hiệu MCOT2), kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
0,9g Silicagel
3g Silicagel thấm AgNO3 10% loại bỏ hợp chất chứa sun fua
3g Silicagel thấm KOH 2% loại bỏ hợp chất cú tớnh axit 4,5g Silicagel thấm H2SO4 44% để thủy phõn cỏc chất bộo
6g Silicagel thấm H2SO4 22%, loại bỏ nền và thủy phõn cỏc chất bộo.
6g NaSO4 10% loại bỏ H2O trong quỏ trỡnh tỏch chiết (ngƣời sử dụng thờm vào)
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Hỡnh 3.13: Sắc đồ của mẫu chuẩn cú nồng độ 100pg/àl trước khi qua cột Silicagel
# min scan scan scan TY height area % max. total --- --- --- ---- ---- --- --- --- --- --- 1 10.866 866 874 927 BV 6700 207234 100.00% 100.000% 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 Time--> Abundance
TIC: CHUAN DIOXIN MCOT1.D\DATASIM.MS
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Hỡnh 3.14: Sắc đồ của mẫu chuẩn cú nồng độ 100pg/àl sau khi qua cột Silicagel
# min scan scan scan TY height area % max. total --- --- --- ---- ---- --- --- --- --- ---
1 10.871 845 875 908 BV 6099 186098 100.00% 98.908%
Nhận xột: từ kết quả trờn cho thấy hiệu suất thu hồi của quỏ trỡnh làm sạch bằng cột silicagel đa lớp đạt 6069/6700 = 90,58%. Kết quả này phự hợp khoảng hiệu suất thu hồi mà nhà sản xuất đƣa ra (đạt trờn 85%).
3.6.3. Hiệu suất thu hồi của quỏ trỡnh làm sạch với cột carboxen 2 lớp
Cấu tạo của cột Carboxen 2 lớp sử dụng:
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 Time--> Abundance
TIC: CHUAN DIOXIN MCOT2.D\DATASIM.MS
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Hỡnh 3.15: Cấu tạo của cột Carboxen 2 lớp của hóng Supelco
Tiến hành thực nghiệm nhƣ sau:
Trƣớc khi sử dụng cột than 2 lớp, tiến hành hoạt húa cột bằng cỏch: cho 40ml Toluene qua cột với tốc độ cỡ 1-2ml/phỳt. Sau đú cho tiếp 50ml n-hexane qua cột với cũng với tốc độ nhƣ trờn, tiếp tục cho thờm 50ml n-hexane qua cột lần thứ 2, loại bỏ toàn bộ dung dịch qua cột.
Lấy 1ml chất chuẩn cú nồng độ 100pg/àl 2,3,7,8 – TCDD cho qua cột than, cho tiếp 30ml hỗn hợp dung mụi dichloromethane 3,3% (V/V) trong n-hexane đi qua cột với tốc độ cỡ 1-2ml/phỳt. Loại bỏ phần dung dịch qua cột.
Tiến hành rửa giải phõn đoạn PCDD/PCDF bằng 120ml Toluene chia làm 3 lần, mỗi lần 40ml qua cột với tốc độ cỡ 1-2ml/phỳt. Thu phần dung dịch qua cột và làm cụ đặc đến 1ml. Đem phõn tớch mẫu trờn mỏy (MCOT3)
Lớp Cacbon – 1016, diện tớch bề mặt = 75 m2 /g Lớp Cacbon – 1000, diện tớch bề mặt = 1200 m2/g Dũng mẫu
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
# min scan scan scan TY height area % max. total --- --- --- ---- ---- --- --- --- --- --- 1 10.866 866 874 927 BV 6700 207234 100.00% 100.000% 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 50 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 Time--> Abundance
TIC: CHUAN DIOXIN MCOT1.D\DATASIM.MS
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Hỡnh 3.16: Sắc đồ của mẫu chuẩn cú nồng độ 100pg/àl sau khi qua cột Carboxen
# min scan scan scan TY height area % max. total --- --- --- ---- ---- --- --- --- --- ---
1 10.884 873 869 913 BV 3326 105246 100.00% 76.925%
Nhận xột: từ kết quả trờn cho thấy hiệu suất thu hồi của quỏ trỡnh làm sạch bằng cột than 2 lớp đạt 3326/6700 = 49,64%.
Thực tế, nhà sản suất cột Carboxen 2 lớp khụng đƣa ra giỏ trị hiệu suất thu hồi cú thể đạt đƣợc sau quỏ trỡnh làm sạch với cột than vỡ bản chất của quỏ trỡnh này là dioxin sẽ bị giữ lại cột than, sau đú đƣợc rửa giải bằng hỗn hợp dung mụi thớch hợp, thu hồi lại dioxin. Do đú, lƣợng dioxin thu lại đƣợc trong quỏ trỡnh này phần lớn phụ thuộc vào lƣợng hỗn hợp dung mụi rửa giải và thao tỏc của cỏn bộ phõn tớch.
3.7. Đỏnh giỏ khả năng phõn tớch cỏc hợp chất dioxin/furan
Để đỏnh giỏ khả năng ứng dụng và độ tin cậy của phƣơng phỏp GC-MS/NCI, một số yếu tố nhƣ: Giới hạn phỏt hiện; Độ tuyến tớnh và khoảng tuyến tớnh; độ chụm và độ đỳng của phƣơng phỏp đó đƣợc nghiờn cứu. Lần lƣợt kiểm tra từng yếu tố trờn bằng cỏch phõn tớch chất chuẩn với 2 kỹ thuật GC-MS/NCI; GC-MS/EI để so sỏnh, đỏnh giỏ. Time--> 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 500 1000 1500 2000 2500 3000 Abundance
TIC: CHUAN DIOXIN MCOT3.D\DATASIM.MS
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
3.7.1. Giới hạn phỏt hiện
Giới hạn phỏt hiện của phƣơng phỏp đối với một chất đƣợc định nghĩa là hàm lƣợng nhỏ nhất của chất đú cú trong mẫu mà tại hàm lƣợng đú, mẫu chất cú tớn hiệu lớn hơn 2,5 lần tớn hiệu nhiễu trung bỡnh khi ỏp dụng phƣơng phỏp đú để phõn tớch [24, 25]. Núi cỏch khỏc, để đỏnh giỏ giới hạn phỏt hiện của phƣơng phỏp với 1 chất, cần tiến hành làm giảm nồng độ chất phõn tớch đến khi nào pic của chất đú cú giỏ trị tớn hiệu/nhiễu (S/N) đạt giỏ trị 2,5. Khi đú, hàm lƣợng của chất tại thời điểm đấy chớnh là giới hạn phỏt hiện của phƣơng phỏp đối với chất đú. Giới hạn phỏt hiện là một thụng số quan trọng đỏnh giỏ giỏ trị sử dụng của phƣơng phỏp. Cỏc nhà khoa học đó và đang khụng ngừng nghiờn cứu, tỡm cỏc giải phỏp kỹ thuật để hạ thấp hơn nữa giới hạn phỏt hiện với cỏc chất.
Trƣớc hết, sử dụng dóy chất chuẩn chứa cỏc chất dioxin/furan với nồng độ 0,5 đến 2,5 pg/l, phõn tớch trờn mỏy ở 2 chế độ ion húa là EI và NCI kết hợp giỏm sỏt cỏc ion đơn (SIM) đƣợc đƣa ra trong bảng 3.4 và bảng 3.1 để đỏnh giỏ ban đầu.
Bảng 3.4: Cỏc ion dương được giỏm sỏt khi phõn tớch EI phõn tớch mẫu cỏc chất dioxin/furan
Tetra Penta Hexa Hepta Octa
PCDFs 306 340 374 410 442
PCDDs 322 356 390 426 460
Sau khi phõn tớch, tỷ số giữa tớn hiệu của pic và nhiễu (S/N) của cỏc ion đặc trƣng của mỗi chất đƣợc tớnh và liệt kờ ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Tỷ lệ tớn hiệu/nhiễu khi phõn tớch 17 đồng loại độc dioxin/furan nồng độ 0,5 đến 2,5pg/l bằng kỹ thuật GC-MS/EI và GC-MS/NCI
TT Tờn chất Nồng độ (pg/l) S/N (Tớn hiệu/ Nhiễu) GC-MS/EI GC-MS/NCI 1 2,3,7,8-TCDD 0,5 2,80 KPH 2 1,2,3,7,8-PeCDD 0,5 8,47 19,8
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22 4 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,25 4,98 311,5 5 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,25 3,98 38,7 6 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,25 2,99 176,5 7 OCDD 2,5 5,86 905,4 8 2,3,7,8-TCDF 0,5 2,56 44,4 9 1,2,3,7,8-PeCDF 0,5 8,52 1.137 10 2,3,4,7,8-PeCDF 0,5 8,10 992,6 11 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,25 7,74 2.789 12 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,25 9,00 3.795 13 1,2,3,7,8,9-HxCDF 1,25 6,53 2.837 14 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,25 3,96 1.181 15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,25 6,44 3.740 16 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 1,25 3,31 1.929 17 OCDF 2,5 5,89 4.137
Kết quả cho thấy, ở cựng điện thế cấp của detector khối lƣợng là 1600V, phõn tớch dóy cỏc chất dioxin/furan với nồng độ 0,5 – 2,5 pg/l, với kỹ thuật EI, một số đồng loại độc nhƣ 2,3,7,8-TCDD; 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF; 1,2,3,4,6,7,8- HpCDD; 2,3,7,8-TCDF, đó chạm đến giới hạn phõn tớch định tớnh. Tuy nhiờn, khi dựng NCI, chiều cao pic của hầu hết cỏc chất đều lớn hơn gấp nhiều lần so với EI. Tất cả 10 đồng loại độc của Furans đạt kết quả rất tốt, cỏc pic thu đƣợc cú tỷ lệ S/N cao gấp 17 đến hơn 700 lần. Cỏc đồng loại độc của dioxin (ngoại trừ 2,3,7,8- TCDD) cũng cho kết quả tốt hơn rất nhiều so với kỹ thuật EI. Đặc biệt cỏc đồng loại độc dioxin/furan chứa từ 6 đến 8 nguyờn tử clo cho kết quả rất tốt với NCI.
Tiếp tục thay đổi nồng độ của cỏc chất dioxin/furan trong mẫu và phõn tớch bằng cả 2 kỹ thuật để xỏc định giới hạn phỏt hiện của phƣơng phỏp đối với nhúm dioxin/furan. Kết quả thử nghiệm đƣợc đƣa ra trong bảng 3.6.
Bảng 3.6: Tỷ lệ tớn hiệu/nhiễu khi phõn tớch 17 đồng loại độc của dioxin/furan ở cỏc nồng độ khỏc nhau bằng kỹ thuật GC-MS/EI và GC-MS/NCI
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22 TT Tờn chất EI NCI Nồng độ (pg/l) S/N Nồng độ (pg/l) S/N 1 2,3,7,8-TCDD 0,5 2,8 2,5 2,6 2 1,2,3,7,8-PeCDD 0,2 2,8 0,075 2,7 3 1,2,3,4,7,8-HxCDD 0,5 2,6 0,045 2,8 4 1,2,3,6,7,8-HxCDD 0,5 2,6 0,015 2,7 5 1,2,3,7,8,9-HxCDD 0,5 2,3 0,085 2,6 6 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,25 3,0 0,035 2,7 7 OCDD 0,5 2,7 0,0075 2,8 8 2,3,7,8-TCDF 0,5 2,6 0,04 2,9 9 1,2,3,7,8-PeCDF 0,2 2,7 0,001 3,0 10 2,3,4,7,8-PeCDF 0,2 2,6 0,001 2,6 11 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,5 2,2 0,001 2,7 12 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,5 2,8 0,0075 2,5 13 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,75 3,2 0,001 2,8 14 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,0 3,6 0,003 2,9 15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,75 3,1 0,0075 2,5 16 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 1,25 3,31 0,0015 2,4 17 OCDF 1,25 2,7 0,0015 2,6
Quan sỏt bảng 3.6 ta thấy, tại cỏc nồng độ đƣợc thử nghiệm, tỷ số S/N xấp xỉ 2,5 đó gần tới giới hạn phỏt hiện của phƣơng phỏp đối với mỗi chất. Với phƣơng phỏp GC-MS/EI thỡ 2,3,4,7,8-PeCDF là chất cú giới hạn phỏt hiện thấp nhất (xấp xỉ 0,2pg/l) đõy cũng là ngƣỡng giới hạn phỏt hiện tốt đối với kỹ thuật MS/EI. Tuy nhiờn, khi quan sỏt kết quả phõn tớch với kỹ thuật MS/NCI ta thấy giới hạn định lƣợng của mỗi chất đƣợc hạ thấp xuống rất nhiều, đặc biệt là nhúm chất furan, giới
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22 đến lƣợng chất cỡ femtogram, đõy là một ngƣỡng phõn tớch rất thấp mà thụng
thƣờng chỉ cú kỹ thuật khối phổ phõn giải cao mới đạt đƣợc.
Một hạn chế lớn của NCI là rất kộm nhạy đối với đồng loại độc độc nhất, quan trọng nhất của cỏc chất dioxin/furan là 2,3,7,8-TCDD, giới hạn định lƣợng của nú là 2,5pg/l, cao gấp 5 lần so với kỹ thuật MS/EI. Do đú, khi phõn tớch ở hàm lƣợng siờu vết mà sử dụng NCI vớ dụ nhƣ trong phõn tớch kiểm tra hàm lƣợng cỏc chất dioxin/furan trong mỏu, trong thực phẩm, vẫn cần phải sử dụng khối phổ phõn giải cao để kiểm chứng sự tồn tại của 2,3,7,8-TCDD trong mẫu.
Tuy nhiờn, chỳng ta hoàn toàn cú thể sử dụng NCI trờn mỏy khối phổ phõn giải thấp để phõn tớch, đỏnh giỏ sơ bộ hàm lƣợng dioxin/furan với lƣợng siờu vết (cỡ vài chục femtogram) mà khụng cần dựng thiết bị khối phổ phõn giải cao để hạ giỏ thành đầu tƣ thiết bị, giỏ thành phõn tớch mẫu.