gen và kiểu gen phụ của HCV
Xác định chính xác tác nhân HCV là mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ, từ đó tiến hành điều trị, theo dõi diễn tiến và biến chứng của bệnh cũng như phòng ngừa sự lây truyền của vi rút viêm gan C. Hiện nay tại Việt nam phổ biến 3 kỹ thuật xác định kiểu gen của vi rút viêm gan C là real time PCR, LiPA và sequencing.
Việc xác định kiểu gen của vi rút viêm gan C bằng kỹ thuật LiPA được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm PCR do dễ thực hiện, không đòi hỏi máy móc, trang thiết bị và kỹ thuật cao. Tuy nhiên kỹ thuật này lại kém hiệu quả trong việc phân biệt các kiểu gen 1b và 1a, 2a và 2c, giữa 4a, 4c và 4d bởi kỹ thuật này sử dụng đoạn 5’-UTR. Gần đây, LiPA đã được cải tiến nâng hiệu suất bằng cách khuếch đại đồng thời cả khu vực core nhằm giảm thiểu các nhược điểm trước đây [18]
.
Xác định kiểu gen bằng kỹ thuật Real time PCR có giá thành rẻ hơn 9 lần so với kỹ thuật LiPA [50]
, tuy nhiên kỹ thuật này chỉ sử dụng đoạn trình tự ngắn cho mồi và mẫu dò, dẫn đến có thể nhầm lẫn trong xác định kiểu gen 1 và một vài kiểu gen phụ của kiểu gen 6. Nghiên cứu của tác giả Stephane Chevaliez và cs cho biết có 10% trường hợp xác định sai genopype 1 khi sử dụng kỹ thuật Real time PCR [49]
.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật sequencing để xác định kiểu gen của vi rút viêm gan C. Kỹ thuật sequencing tuy đòi hỏi các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều kiện kỹ thuật cao nhưng lại xác định được kiểu gen cụ thể, có ý nghĩa trong nghiên cứu sự biến đổi vùng gen mà kỹ thuật LiPA không thực
45
hiện được. Tính ưu việt của kỹ thuật sequencing trong việc xác định kiểu gen là sự chính xác [4][49] .
Do mức độ bảo tồn cao giữa các phân nhóm khác nhau, một số cơ sở y tế hiện nay sử dụng kỹ thuật sequencing dựa vào vùng chưa được dịch mã - 5’UTR để xác định kiểu gen của vi rút viêm gan C. Tuy nhiên nếu dựa vào trình tự vùng 5’UTR, các phân nhóm có liên quan chặt chẽ trong cùng một kiểu gen sẽ không được phân biệt rõ ràng và đầy đủ [26]
. Theo nghiên cứu của Stephane Chevaliez và cs, khi giải trình tự gen vùng 5’UTR, khoảng 22,8% - 29,5% trường hợp không xác định được chính xác kiểu gen phụ 1a, đối với kiểu gen phụ 1b là 9,5% - 8,7% trường hợp [49]
.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, trình tự của một vùng mã hóa thích hợp, như 5B khu vực nonstructural (NS5B), core, hay E1 là tiêu chuẩn vàng xác định các loại vi rút viêm gan C và phân nhóm [37] [47]. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn giải trình tự gen tại khu vực core - khu vực bảo tồn dài nhất, với cặp mồi Sc2, Ac2, S7, A5 (Bảng 2.1). Kỹ thuật này tuy mất thời gian và thường đòi hỏi một số bước xử lý mẫu trước khi tiến hành, nhưng thu được kết quả chính xác và đáng tin cậy. Nhược điểm của kỹ thuật này, khi sử dụng mỗi cặp mồi ở một lần tiến hành chỉ cho được kết quả một kiểu gen duy nhất, chính vì vậy không xác định được các trường hợp đồng nhiễm kiểu gen. Muốn xác định đồng nhiễm kiểu gen, chúng ta cần làm thêm giải trình tự gen trên khu vực khác nữa NS3 hoặc NS5B. Do kinh phí hạn hẹp, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng một cặp mồi, vì vậy không xác định được đồng nhiễm kiểu gen HCV trên một bệnh nhân. Đây cũng chính là hạn chế của nghiên cứu này.
