Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ đồng nhiễm HCV và HIV
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ đồng nhiễm HCV và HIV là 29% (Biểu đồ 3.2). Đồng nhiễm viêm gan C với HIV là yếu tố nguy cơ cao dẫn tới xơ
43
gan. HIV dương tính và số lượng CD4 thấp làm tăng tốc độ xơ hóa gan trong nhiễm HCV [19] [41]. Ngược lại, HCV làm tăng tiến triển từ nhiễm HIV đến hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) [29]
. Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Tuyết Vân, cho thấy trong 369 trường hợp nhiễm viêm gan vi rút C, tỷ lệ đồng nhiễm HIV với HCV là 20,9% [13]
.
Các nghiên cứu khác ở Tây Âu và Mỹ cho thấy đồng nhiễm HCV/HIV chiếm tỷ lệ từ 25 đến 30% [33]. Tuy nhiên, tỷ lệ đồng nhiễm có thể thay đổi phụ thuộc vào nhóm đối tượng nghiên cứu cũng như các thời điểm nghiên cứu. Tỷ lệ đồng nhiễm HCV/HIV thường cao trong nhóm đối tượng tiêm chích ma túy.
3.1.5. Tải lƣợng vi rút HCV
Bảng 3.3. Đặc điểm về tải lƣợng vi rút của mẫu nghiên cứu Tải lƣợng vi rút
(bản sao/mL)
10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 Tổng
n 16 13 30 32 17 108
% 15 12 28 29 16 100
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan, khuếch đại axít nucleic trong huyết thanh bằng cách sử dụng thiết bị COBAS AmpliPrep xử lý mẫu tự động và COBAS TaqMan để tự động khuếch đại và phát hiện, nhờ đó định lượng RNA của vi rút viêm gan C trong máu. Đây là kỹ thuật PCR theo thời gian thực có độ đặc hiệu cao (99,6%) và khoảng dao động rộng giúp phát hiện và định lượng HCV RNA. Ngưỡng phát hiện 38- 172.500.000 bản sao/mL [43].
Trong nghiên cứu của chúng tôi, là mẫu máu các bệnh nhân đã được xác định kiểu gen HCV thành công, tải lượng vi rút viêm gan C trong máu dao động từ
44
103 đến 107 bản sao/mL, trong đó có 32 mẫu có tải lượng vi rút là 106 bản sao/mL, chiếm 29%. (Bảng 3.3.)
3.2. Phân bố kiểu gen của HCV ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại BVBNĐTƯ BVBNĐTƯ
3.2.1. Lý do lựa chọn kỹ thuật sequencing tại khu vực core để xác định kiểu gen và kiểu gen phụ của HCV gen và kiểu gen phụ của HCV
Xác định chính xác tác nhân HCV là mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ, từ đó tiến hành điều trị, theo dõi diễn tiến và biến chứng của bệnh cũng như phòng ngừa sự lây truyền của vi rút viêm gan C. Hiện nay tại Việt nam phổ biến 3 kỹ thuật xác định kiểu gen của vi rút viêm gan C là real time PCR, LiPA và sequencing.
Việc xác định kiểu gen của vi rút viêm gan C bằng kỹ thuật LiPA được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm PCR do dễ thực hiện, không đòi hỏi máy móc, trang thiết bị và kỹ thuật cao. Tuy nhiên kỹ thuật này lại kém hiệu quả trong việc phân biệt các kiểu gen 1b và 1a, 2a và 2c, giữa 4a, 4c và 4d bởi kỹ thuật này sử dụng đoạn 5’-UTR. Gần đây, LiPA đã được cải tiến nâng hiệu suất bằng cách khuếch đại đồng thời cả khu vực core nhằm giảm thiểu các nhược điểm trước đây [18]
.
Xác định kiểu gen bằng kỹ thuật Real time PCR có giá thành rẻ hơn 9 lần so với kỹ thuật LiPA [50]
, tuy nhiên kỹ thuật này chỉ sử dụng đoạn trình tự ngắn cho mồi và mẫu dò, dẫn đến có thể nhầm lẫn trong xác định kiểu gen 1 và một vài kiểu gen phụ của kiểu gen 6. Nghiên cứu của tác giả Stephane Chevaliez và cs cho biết có 10% trường hợp xác định sai genopype 1 khi sử dụng kỹ thuật Real time PCR [49]
.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật sequencing để xác định kiểu gen của vi rút viêm gan C. Kỹ thuật sequencing tuy đòi hỏi các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều kiện kỹ thuật cao nhưng lại xác định được kiểu gen cụ thể, có ý nghĩa trong nghiên cứu sự biến đổi vùng gen mà kỹ thuật LiPA không thực
45
hiện được. Tính ưu việt của kỹ thuật sequencing trong việc xác định kiểu gen là sự chính xác [4][49] .
Do mức độ bảo tồn cao giữa các phân nhóm khác nhau, một số cơ sở y tế hiện nay sử dụng kỹ thuật sequencing dựa vào vùng chưa được dịch mã - 5’UTR để xác định kiểu gen của vi rút viêm gan C. Tuy nhiên nếu dựa vào trình tự vùng 5’UTR, các phân nhóm có liên quan chặt chẽ trong cùng một kiểu gen sẽ không được phân biệt rõ ràng và đầy đủ [26]
. Theo nghiên cứu của Stephane Chevaliez và cs, khi giải trình tự gen vùng 5’UTR, khoảng 22,8% - 29,5% trường hợp không xác định được chính xác kiểu gen phụ 1a, đối với kiểu gen phụ 1b là 9,5% - 8,7% trường hợp [49]
.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, trình tự của một vùng mã hóa thích hợp, như 5B khu vực nonstructural (NS5B), core, hay E1 là tiêu chuẩn vàng xác định các loại vi rút viêm gan C và phân nhóm [37] [47]. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn giải trình tự gen tại khu vực core - khu vực bảo tồn dài nhất, với cặp mồi Sc2, Ac2, S7, A5 (Bảng 2.1). Kỹ thuật này tuy mất thời gian và thường đòi hỏi một số bước xử lý mẫu trước khi tiến hành, nhưng thu được kết quả chính xác và đáng tin cậy. Nhược điểm của kỹ thuật này, khi sử dụng mỗi cặp mồi ở một lần tiến hành chỉ cho được kết quả một kiểu gen duy nhất, chính vì vậy không xác định được các trường hợp đồng nhiễm kiểu gen. Muốn xác định đồng nhiễm kiểu gen, chúng ta cần làm thêm giải trình tự gen trên khu vực khác nữa NS3 hoặc NS5B. Do kinh phí hạn hẹp, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng một cặp mồi, vì vậy không xác định được đồng nhiễm kiểu gen HCV trên một bệnh nhân. Đây cũng chính là hạn chế của nghiên cứu này.
3.2.2. Phân bố kiểu gen của HCV
Trong nghiên cứu của chúng tôi, kiểu gen HCV 1 chiếm đa số với tỷ lệ 57,41%, kiểu gen HCV 6 chiếm 39,81%, còn lại là kiểu gen HCV 3 chiếm 2,78%. (Biểu đồ 3.3). Khi nghiên cứu về kiểu gen vi rút viêm gan C ở khu vực Hà nội, tác giả Nguyễn Nghiêm Luật và cs đã xác định được 3 kiểu gen, đó là các kiểu gen 1, 2
46
và 6 với tỷ lệ kiểu gen HCV 1 là 68,57%, kiểu gen HCV 2 là 5,88% và kiểu gen HCV 6 là 25,71% [9]. So với các kiểu gen đã được công bố ở khu vực miền Bắc trong nghiên cứu của Học viện Quân Y 108 năm 2007 kiểu gen HCV 1 chiếm ưu thế với tỷ lệ 65,33%, tiếp theo là kiểu gen HCV 6 với 18,67%. Kiểu gen HCV 2 chiếm 6,67%. Ngoài ra trong nghiên cứu này còn xác định thêm kiểu gen HCV 7 (8%) và kiểu gen HCV 8 (1,33%) [9]. Tuy nhiên theo phân loại kiểu gen mới, kiểu gen HCV từ 7 đến 11 được xác định là các biến thể của kiểu gen HCV 3 (kiểu gen 10a) và kiểu gen HCV 6a (kiểu gen 7, 8, 9, 11) và đã được phân loại là kiểu gen phụ của kiểu gen HCV 3 và kiểu gen HCV 6 [32].
Nghiên cứu khác ở khu vực miền nam của công ty Nam Khoa cũng cho kết quả tương tự với kiểu gen HCV 1 chiếm ưu thế với 71,02%, kiểu gen HCV 6 chiếm 18,62% và kiểu gen HCV 2 chiếm 10,31%. Ở nghiên cứu của công ty Nam khoa, tỷ lệ kiểu gen 3 chiếm 0,05% và kiểu gen HCV 4 chiếm 0,05% [9]. Nghiên cứu của tác giả Hồ Tấn Đạt và cs xác định được 3 kiểu gen chính là 1, 6 và 2, trong đó kiểu gen HCV 1 chiếm 58,4%, kiểu gen HCV 6 chiếm 23,9%, kiểu gen HCV 2 chiếm 13,1% và chỉ có duy nhất 1 trường hợp có kiểu gen HCV 3 (0,3%). Có 4,3% trường hợp không xác định được kiểu gen [4]
.
39,81% 57,41%
2,78%
Type 1 Type 3 Type 6
47
Trong nghiên cứu của chúng tôi, không phát hiện trường hợp nào có kiểu gen HCV 2 và HCV 4 như các nghiên cứu trên. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định được 3 bệnh nhân có kiểu gen HCV 3 (2,78%) (Biểu đồ 3.3). Các nghiên cứu gần đây cho thấy kiểu gen HCV 3 là kiểu gen phổ biến trong nhóm tiêm chích ma túy và có xu hướng ngày càng tăng trên toàn cầu [23] [48]
. Nhiễm HCV kiểu gen 3 mạn tính thường gây hậu quả làm các tế bào gan nhiễm mỡ do ức chế tiết lipoprotein trong quá trình vi rút nhân lên [32].
Theo tác giả Ming-Lung Yu và cs thống kê tại Việt Nam, Hồng Kông và Ma Cao, tỷ lệ kiểu gen HCV 1 chiếm 50%, tiếp theo là kiểu gen HCV 6 chiếm 30%, kiểu gen HCV 2 chiếm 8% và kiểu gen HCV 3 chiếm 7% [32]. Tỷ lệ kiểu gen các vùng công bố có sự khác nhau nhỏ, điều này có thể do vùng địa lý, thời điểm nghiên cứu và số lượng bệnh nhân được nghiên cứu khác nhau. Kiểu gen HCV 1 là kiểu gen khó đáp ứng với điều trị đặc hiệu, đồng thời cũng chiếm tỷ lệ cao trong các trường hợp tái phát [12] [14] [27]
. Kiểu gen HCV 6 chiếm tỷ lệ cao ở vùng Đông Nam Á, thường có đáp ứng tốt hơn với điều trị bằng Interferon, tuy nhiên, về đặc điểm lâm sàng và các tác dụng phụ khi điều trị bằng Interferon thì không có sự khác biệt so với các kiểu gen khác [17].
3.2.3. Phân bố kiểu gen phụ của HCV
Việc xác định kiểu gen phụ của vi rút viêm gan C có vai trò quan trọng, giúp người thầy thuốc đánh giá đáp ứng đối với điều trị và tiên lượng khả năng xơ gan cũng như ung thư tế bào gan. Trong nghiên cứu của chúng tôi, kiểu gen 1a chiếm 31,5%, kiểu gen 1b chiếm 25,9%; có 3 trường hợp có kiểu gen 3b chiếm 2,78%; có 19,4% có kiểu gen 6a; 10,2% kiểu gen 6e; 6,5% kiểu gen 6h; 2,78% kiểu gen 6k và 0,94% có kiểu gen phụ 6l (Biểu đồ 3.4).
48
Biểu đồ 3.4. Phân bố các kiểu gen phụ của HCV
Một nghiên cứu tiến hành ở Hải Phòng cũng cho thấy kiểu gen 1a phổ biến hơn so với kiểu gen 1b với tỷ lệ lần lượt là 23,7% và 20,6% [54]
. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng, hầu hết các chủng có liên quan về kiểu gen với các chủng ở Hà nội, thành phố Hồ Chí Minh và Mỹ [54]. Nghiên cứu của tác giả Phạm Song trên 93 người cho máu cũng cho thấy chủ yếu là 2 loại kiểu gen 1a (29%) và kiểu gen 1b (23%) [40]. Tuy nhiên, theo một số nghiên cứu khác lại thấy rằng kiểu gen 1b chiếm tỷ lệ cao hơn. Nguyễn Thanh Hảo và cs xác định kiểu gen HCV trên 123 đối tượng cho máu tình nguyện thấy rằng kiểu gen 1b chiếm 48,8%, kiểu gen 1a chiếm 15,4%
[5]. Nghiên cứu tại Bệnh viện MEDLATEC cũng cho thấy kiểu gen 1b (44,44%) chiếm ưu thế hơn so với kiểu gen 1a (25%) [9]
. Sự khác biệt này có thể do vùng địa lý, thời điểm nghiên cứu, đối tượng và số lượng bệnh nhân của mỗi nghiên cứu là khác nhau.
Trên thế giới, kiểu gen 1a và 1b là các kiểu gen phổ biến nhất ở Hoa Kỳ và cũng là hai kiểu gen chiếm ưu thế ở Châu Âu [12]
. Tại Nhật Bản, kiểu gen 1b chiếm 73% kiểu gen các trường hợp nhiễm vi rút viêm gan C [53]. Tại Pháp, kiểu gen 1b và 3a thường hay gặp ở bệnh nhân viêm gan vi rút C mạn tính, trong đó kiểu gen 1b thường hay gặp ở bệnh nhân lớn tuổi và bị nhiễm do chạy thận nhân tạo [25]
. Nghiên cứu của Trịnh Thị Ngọc và cộng sự tiến hành trên các bệnh nhân có tiền sử tiêm chích ma túy cho thấy rằng, kiểu gen 1a chiếm 32% và kiểu gen 1b chiếm 12,8% [11]
49
cứu này còn chỉ ra rằng, bệnh nhân viêm gan vi rút C mạn tính có kiểu gen 1b thường diễn biến nặng và ít chịu ảnh hưởng với Interferon alpha trong điều trị.
Kiểu gen 3a phổ biến trong nhóm người tiêm chích ma túy ở Châu Âu và Mỹ
[12]. Trong khi đó, ở Việt Nam, kiểu gen 3 lại chiếm tỷ lệ rất thấp. Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 3 trường hợp có kiểu gen 3b chiếm 2,78%, không có trường hợp nào có kiểu gen 3a (Biểu đồ 3.4). Theo nghiên cứu của Tomoaki và cs, bằng kỹ thuật giải trình tự gen khu vực 5’UTR-Core, tác giả phát hiện được 3 trường hợp có kiểu gen 3a (1,5%) và 8 trường hợp có kiểu gen 3b (4,1%) [54]
. Nghiên cứu tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2006 cũng chỉ phát hiện được duy nhất một trường hợp có kiểu gen 3b (0,3%) [4]. Các nghiên cứu khác tại Bệnh viện Trung Ương Quân đội 108 năm 2004 và Bệnh viện MEDLATEC năm 2011 đều không phát hiện trường hợp nào có kiểu gen 3 [3][9]
.
Kiểu gen HCV 6 được phát hiện chủ yếu ở các nước Đông Nam Á như Singapore, Lào, Thái Lan, Việt Nam và các nước lân cận như miền nam Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Ma Cao. Kiểu gen HCV 6 là kiểu gen duy nhất đa dạng với 22 phân nhóm hiện được ký hiệu theo thứ tự bảng chữ cái từ 6a đến 6v [17]. Kiểu gen 6a, 6d, 6e, 6h, 6l và 6t là các kiểu gen được phát hiện chủ yếu ở Việt Nam
[17]
. Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 21 trường hợp có kiểu gen 6a chiếm 19,4%, 11 trường hợp có kiểu gen 6e (10,2%), 7 trường hợp có kiểu gen 6h là 6,5%, 3 trường hợp có kiểu gen 6k (2,78%) và 1 trường hợp có kiểu gen 6l (0,94%) (Biểu đồ 3.4). Cùng kỹ thuật như chúng tôi, xác định kiểu gen bằng giải trình tự gen khu vực core, theo tác giả Phạm Đức Anh và cs, có 26 trường hơp có kiểu gen 6a chiếm 37,1%, 6 trường hợp có kiểu gen 6e (8,6%) và 1 trường hợp có kiểu gen 6l (1,4%) [39]
. Một nghiên cứu khác ở Hà nội cũng xác định được 8 trường hợp có kiểu gen 6a (22,22%) và 1 trường hợp có kiểu gen 6c (2,78%) [9]
. Kiểu gen 6 được đánh giá là có đáp ứng tốt hơn với điều trị bằng Interferon alpha so với kiểu gen 1 [17], tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng đáp ứng với điều trị của các kiểu gen phụ.
Kiểu gen 2a và 2b tương đối phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu và Nhật Bản, trong khi kiểu gen HCV 4 phổ biến ở Bắc Phi và Trung Đông [12]. Tuy nhiên, ở Việt
50
nam, kiểu gen HCV 2 và kiểu gen HCV 4 chiếm tỷ lệ rất thấp. Trong nghiên cứu của Nguyễn Nghiêm Luật và cs, có 2 bệnh nhân có kiểu gen 2a chiếm 5,56%, và không có trường hợp nào có kiểu gen 2b và kiểu gen HCV 4 [9]. Nghiên cứu tiến hành tại Hải phòng năm 2010 cũng chỉ phát hiện được duy nhất 1 trường hợp kiểu gen 2a (0,5%) [54]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, không phát hiện trường hợp nào có kiểu gen HCV 2 và kiểu gen HCV 4.
Để tìm hiểu mối quan hệ kiểu gen của các chủng thu được tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, chúng tôi tiến hành phân tích các trình tự gen thu được bằng phương pháp phả hệ, sử dụng chương trình MEGA5.1. Các trình tự gen tham khảo gồm: 1a JN214680 (Mỹ); 1a HQ229265 (Thái Lan); 1a AB522986 (Việt Nam); 1b JQ888223 (Bangladesh); 1b JN214848 (Mỹ).
51
Hình 10: Cây phát sinh loài của kiểu gen phụ 1b
Phân tích kiểu gen 1a dựa trên trình tự gen vùng core, chúng tôi thấy rằng các trình tự gen có kiểu gen phụ 1a gần với kiểu gen 1a phân lập được tại Hải Phòng, Thái Lan và Mỹ (Hình 9). Về kiểu gen phụ 1b, các trình tự phân lập được trong nghiên cứu của chúng tôi có mỗi quan hệ gần gũi với kiểu gen phụ 1b phân lập từ Bangladesh và từ Mỹ (Hình 10). Phân tích cả hai kiểu gen 1a và 1b chúng tôi thấy kiểu gen trong nghiên cứu của chúng tôi đều có mối quan hệ gần gũi với các kiểu gen HCV từ Mỹ, điều này có thể gợi ý rằng đã có sự lây truyền kiểu gen này giữa các lục địa có thể qua nhiều con đường khác nhau.
Cây phát sinh kiểu gen HCV dựa trên trình tự gen ở vị trí core (Hình 11) cho thấy rằng kiểu gen HCV1 và HCV6 có mối quan hệ gần nhau hơn so với kiểu gen HCV3. Tác giả Phạm Đức Anh và cs nghiên cứu trên 70 bệnh phẩm của những người cho máu có anti- HCV dương tính tại Viện Huyết Học và Truyền máu Trung