version 2, Biorad.
A/ Nguyên lý: Monolisa Anti-HCV PLUS Version 2 là thử nghiệm miễn dịch gắn men dựa trên nguyên lý kỹ thuật sandwich 1 bước nhằm phát hiện kháng thể HCV trong huyết thanh hoặc huyết tương.
B/ Chuẩn bị hoá chất:
-Cơ chất: 1R9:10R8 lưu trong tối sử dụng trong vòng 6h nhiệt độ phòng. -Dung dịch rửa: 1R2: 19 nước cất, lưu ở 2-300C sử dụng trong vòng 2 tuần.
C/ Quy trình:
-Viết danh sách mẫu và bảng sơ đồ mẫu.
-Lấy giá đỡ và các thanh xét nghiệm ra khỏi túi.
-Cho 80 l dung dịch hoà loãng bệnh phẩm (R6) vào mỗi giếng. -Cho 20 l huyết thanh chứng âm (R3) vào các giếng A1, B1.
-Cho 20 l huyết thanh chứng dương (R4) vào các giếng C1, D1, E1.
-Cho 20 l mẫu xét nghiệm lần lượt vào các giếng G1…Trộn đều bằng cách hút nhả lên xuống 3 lần.
-Đậy giếng bằng tấm nhựa để tránh sự bay hơi bề mặt. -Ủ 60 5 phút trong máy ủ ở 370C.
-Bỏ tấm nhựa, cho phiến vào máy rửa, rửa 3 lần không ngâm.
-Cho 100 l dung dịch chất cộng hợp vào các giếng. Đậy phiến bằng tấm nhựa và ủ 30 5 phút ở 370C.
29
-Bỏ tấm nhựa, cho phiến vào máy rửa, rửa 4 lần.
-Cho 100l dung dịch cơ chất (10R8:1R9) vào mỗi giếng. Ủ tối 30 5 phút ở nhiệt độ phòng 18-250C.
-Dừng phản ứng bằng 100l dung dịch R10.
-Đọc ở bước sóng 450/620nm trong vòng 4-30 phút sau khi cho dung dịch dừng phản ứng.
D/ Nhận định kết quả: Việc khẳng định sự có mặt kháng thể HCV của mẫu được so sánh với giá trị chứng ngưỡng
OD (C1) + OD (D1) + OD (E1) Giá trị trung bình chứng ngưỡng =
3 ODR4
Giá trị chứng ngưỡng C.O =
5
Kết quả chấp nhận được khi: Giá trị chứng âm < 0,15
Giá trị chứng dương ≥ 1,0 và ≤ 2,4
Kết luận: Âm tính nếu OD mẫu < C.O (giá trị chứng ngưỡng) Dương tính nếu OD mẫu > C.O
Làm lại nếu C.O -10% < OD mẫu ≤ C.O
2.4.3. Quy trình xác định tải lƣợng vi rút: Sử dụng bộ kít COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV của Roche.
A/ Nguyên lý
Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV là xét nghiệm khuếch đại axít nucleic dùng để định lượng RNA của virút viêm gan C trong huyết thanh người. Thiết bị COBAS AmpliPrep tự động xử lý mẫu và COBAS TaqMan tự động khuếch đại và phát hiện.
30
Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV gồm 3 quá trình chính: (1) Chuẩn bị mẫu để tinh chiết được RNA của HCV;
(2) Sao mã ngược RNA đích để tạo ra DNA bổ trợ (cDNA), và
(3) Đồng thời khuếch đại cDNA đích và phát hiện quá trình bị cắt của mẫu dò gắn 2 màu huỳnh quang đặc hiệu với tác nhân đích.
Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV cho phép tự động chuẩn bị mẫu, sao mã ngược, khuếch đại PCR cùng phát hiện HCV RNA đích và HCV RNA chuẩn định lượng (QS). Thuốc thử Master Mix chứa đoạn mồi và các mẫu dò đặc hiệu cho cả HCV RNA và HCV RNA QS. Thuốc thử Master Mix được phát triển để đảm bảo định lượng tất cả các kiểu gen HCV từ 1 đến 6. Các DNA khuếch đại được phát hiện nhờ sử dụng các mẫu dò đánh dấu đặc hiệu cho tác nhân đích và QS, cho phép phát hiện độc lập sản phẩm khuếch đại của HCV từ mẫu và từ HCV QS.
Xét nghiệm sử dụng HCV QS để định lượng RNA virút HCV. HCV QS cho phép bù trừ ảnh hưởng của những ức chế trong phản ứng PCR và kiểm soát quá trình chuẩn bị và khuếch đại, cho phép định lượng chính xác hơn lượng HCV RNA trong mỗi mẫu. HCV QS là một cấu trúc RNA không lây nhiễm chứa những chuỗi HCV với những vị trí gắn mồi giống hệt như RNA đích HCV và một vùng gắn mẫu dò duy nhất cho phép sản phẩm khuếch đại của HCV QS có thể phân biệt được với sản phẩm khuếch đại của tác nhân đích. HCV QS được thêm vào mỗi mẫu với số lượng xác định và trải qua toàn bộ quá trình chuẩn bị mẫu, sao mã ngược, khuếch đại PCR và phát hiện mẫu dò đánh dấu. Thiết bị phân tích COBAS TaqMan tính nồng độ HCV RNA trong mẫu xét nghiệm bằng cách so sánh tín hiệu HCV với tín hiệu HCV QS cho mỗi mẫu thử và mẫu chứng.
B/ Chuẩn bị mẫu
Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV sử dụng thiết bị COBAS AmpliPrep để chuẩn bị mẫu tự động bằng kỹ thuật tách chiết mẫu dùng hạt
31
từ tính silica. Quy trình sử dụng 850 µL huyết thanh. Protease và phân tử HCV QS RNA có nồng độ xác định được cho vào mỗi mẫu cùng lúc với thuốc thử ly giải và hạt từ tính. Sau đó, hỗn hợp được ủ để HCV RNA và HCV QS RNA gắn kết lên bề mặt của các hạt từ tính. Những phần không gắn kết, như muối, protein, và những tạp chất tế bào khác bị loại bỏ trong quá trình rửa các hạt từ tính. Sau khi tách riêng các hạt từ tính và hoàn tất quá trình rửa, axit nucleic bám trên bề mặt các hạt từ tính sẽ được thôi ra ngoài dung dịch nhờ nhiệt độ cao. Mẫu đã qua xử lý chứa hạt từ tính, HCV RNA và HCV QS RNA đã phân tách, được đưa vào với Master mix và chuyển vào thiết bị phân tích COBAS TaqMan. Tiếp đó, máy sẽ thực hiện sao mã ngược, khuếch đại và phát hiện HCV RNA đích và HCV QS RNA nhờ sự phân cắt mẫu dò đánh dấu kép đặc hiệu cho tác nhân đích và HCV QS.
C/ Phát hiện sản phẩm PCR trong xét nghiệm COBAS TaqMan
Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV sử dụng kỹ thuật PCR theo thời gian thực. Việc sử dụng các mẫu dò phát huỳnh quang đánh dấu kép cho phép phát hiện tức thời sự tích luỹ sản phẩm PCR bằng cách đo cường độ phát huỳnh quang phóng thích ra từ phần nhuộm huỳnh quang trong quá trình khuếch đại. Các mẫu dò bao gồm mẫu dò đặc hiệu HCV và HCV QS có gắn phân tử phát huỳnh quang và phân tử hấp thu huỳnh quang. Khi chất phát huỳnh quang và chất hấp thu huỳnh quang phóng thích và tách ra thì sự hấp thu không còn nữa, do đó tín hiệu huỳnh quang của chất phát huỳnh quang tăng lên. Sự khuếch đại của HCV RNA và HCV QS RNA được đo một cách độc lập ở các bước sóng khác nhau. Quá trình này được lặp lại theo số chu kỳ chỉ định, mỗi chu kỳ làm tăng cường độ phát quang của các chất phát huỳnh quang tương ứng, cho phép phát hiện độc lập HCV RNA và HCV QS RNA. Ở chu kỳ PCR mà đường cong biểu diễn nồng độ theo số mũ bắt đầu vào pha tăng trưởng sẽ tương quan với số lượng nguyên vật liệu ban đầu khi mới tham gia vào PCR. Xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (99,6%) và khoảng động rộng giúp phát hiện và định lượng HCV RNA. Ngưỡng phát hiện 38-172.500.000 bản sao/mL.
32
2.4.4. Tách chiết RNA từ mẫu huyết thanh: Sử dụng bộ kít tách chiết RNA của hãng QIAGEN hãng QIAGEN
- Chuẩn bị
+ Đệm AVL-carrier RNA: cho 310µl đệm AVE vào ống chứa 310 µg lyophilized carrier RNA (dạng đông khô) để thu được dung dịch 1µg/µl, (chia thành các tube nhỏ lưu ở -20o
C, không làm rã đông quá 3 lần nếu lượng mẫu tách chiết < 50 mẫu). Pha đệm AVL và carrier RNA-AVE theo tỷ lệ 100:1 (560 µl AVL và 5,6 µl carrier RNA-AVE).
+ Pha đệm AW1: thêm 25ml ethanol (96-100%) vào 19ml AW1 ban đầu. + Pha đệm AW2: thêm 30ml ethanol (96-100%) vào 13ml AW2 ban đầu. - Tiến hành
Bước 1: Cho 560 µl dung dịch AVL-carrier RNA vào ống eppendorf 1,5ml. Bước 2: Thêm 140 µl huyết thanh vào ống eppendorf trên. Trộn đều (vortex) trong 15 giây.
Bước 3: Ủ ở nhiệt độ phòng 18-25oC trong 10 phút trên giá để mẫu. Bước 4: Ly tâm nhanh.
Bước 5: Thêm 560 µl ethanol (96-100%), trộn đều (vortex) 15 giây. Ly tâm nhanh. Bước 6: Chuyển 630 µl dung dịch trên vào cột QIAamp, đóng nắp và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, giữ lại cột, bỏ ống chứa dịch ở dưới.
Bước 7: Lặp lại bước 6.
Bước 8: Thêm 500 µl dung dịch AW1, đóng nắp và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, giữ lại cột, bỏ ống chứa dịch ở dưới.
Bước 9: Thêm 500 µl dung dịch AW2, đóng nắp và ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút, giữ lại cột, bỏ ống chứa dịch ở dưới.
33
Bước 11: Chuyển cột QIAamp sang ống eppendorf 1,5ml sạch. Thêm 60 µl đệm AVE, đóng nắp và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút rồi ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Bỏ cột, giữ ống dịch ở phía dưới và lưu ở -20ºC hoặc -70ºC.
2.4.5. Xác định kiểu gen HCV bằng kỹ thuật giải trình tự gen
A/ Tổng hợp cDNA: theo quy trình MonsterScrip 1st-Strand cDNA bộ kít của hãng Epicentre.
Bước 1: Pha mix
Nước 8 µl Random primer 2 µl Mẫu bệnh phẩm đã tách chiết 5 µl Bước 2: Ủ mix 650 C trong 1 phút Bước 3: Ủ 40 C trong 1 phút Bước 4: Thao tác tại 40
C
- Thêm 4 µl MonsterScript 5X cDNA PreMix - Thêm 1 µl MonsterScript Reverse Transcriptase
Bước 5: Ly tâm nhẹ, đưa vào máy PCR chạy theo chương trình
370C 5 phút
420C 5 phút
600C 40 phút
900C 5 phút
40C 1 phút
Bước 6: Lưu sản phẩm ở tủ -200C đến khi tiến hành làm xét nghiệm xác định kiểu gen.
34
B/ Phản ứng khuếch đại gen Sc2-Ac2
STT Thành phần Thể tích (20µl) Chu trình nhiệt 1 Nước cất 5 µl 950C 5 phút 2 10 µM Sc2 1 µl 950C 20 giây 3 10 µM Ac2 1 µl 600C 30 giây 4 Đệm 2X 10 µl 720C 1 phút 5 SSIIIRT/Taq 1,5 µl x2 (35) 6 Template 1,5 µl 720C 15 phút 40C ∞ C/ Nested PCR STT Thành phần Thể tích (20µl) Chu trình nhiệt 1 Nước cất 5 µl 950C 5 phút 2 10 µM S7 1 µl 950C 20 giây 3 10 µM A5 1 µl 600C 30 giây 4 Đệm 2X 10 µl 720C 1 phút 5 SSIIIRT/Taq 1,5 µl x2 (35) 6 Template 1,5 µl 720C 15 phút 40C ∞
35
D/ Điện di kiểm tra sản phẩm
Các mẫu sau khi nested PCR được kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên Agarose sử dụng thuốc nhuộm GelGreen
-Chuẩn bị Agarose 1% + bổ sung GelGreen 1%.
-Đun nóng chảy Agarose bằng lò vi sóng (2-3 phút), để nguội đến 55-600
C, đổ bản điện di.
-Sau khoảng 20 phút, bản điện di đã khô, có thể tiến hành điện di. -Thành phần 1 giếng điện di như sau:
5 µl sản phẩm PCR (hoặc thang Maker); 1 µl Loading Dye;
Mix đều và tra lần lượt mẫu vào các giếng. -Điện di với dòng điện 100V trong 30 phút. -Soi kết quả điện di trên máy.
E/ Quy trình tinh sạch: theo bộ kít tinh sạch của hãng QIAGEN
Bước 1: Cho 5 lượng đệm PB vào 1 lượng sản phẩm PCR (75 µl đệm PB vào 15 µl sản phẩm PCR).
Bước 2: Trộn đều, chuyển sang cột QIAquick, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bước 3: Bỏ dịch, giữ lại ống chứa.
Bước 4: Thêm 750 µl đệm PE (đã bổ sung ethanol), ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bước 5: Bỏ dịch, giữ lại ống chứa, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 6: Chuyển cột QIAquick sang ống eppendorf 1,5ml sạch.
Bước 7: Thêm 20 µl đệm EB, đóng nắp và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
36
G/ Đọc trình tự gen
Các mẫu được giải trình tự bằng bộ kit Bigdye 3.1 (ABI), máy 3100.
STT Thành phần Thể tích (10µl) Chu trình nhiệt
1 Nước cất 5 µl 960C 1 phút
2 5X Ready mix 2 µl 960C 10 giây
3 Big Dye 1 µl 500C 5 giây
4 Primer S7 or A5 1 µl 600C 4 phút 5 Template 1 µl X25 (2-4) 40C ∞ Tinh sạch 125mM EDTA 1 µl 99% EtOH 25 µl Mẫu 10 µl - Trộn đều, để nhiệt độ phòng 15 phút; - Ly tâm 3000* 15 phút; - Ly tâm 180* 1 phút; - Thêm 35µl 70% EtOH, trộn nhẹ; - Ly tâm 3000* 15 phút; - Ly tâm 180* 1 phút, để khô;
- Thêm 15 µl Hidi-Formamide, trộn đều; - Biến tính: 95oC 3 phút; 4oC 10 phút;
37
- Cho vào máy đọc trình tự.
2.4.6. Thu thập thông tin từ hồ sơ bệnh án
- Tuổi bệnh nhân được chia thành 2 nhóm ≤ 40 và >40 [1] - Giới tính: nam và nữ
- Tiền sử phơi nhiễm HCV: Tiêm chích ma tuý, quan hệ tình dục không an toàn, truyền máu và các chế phẩm máu.
- Tiêu chuẩn nhiễm HIV: Dựa theo tiêu chuẩn “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS”, ban hành kèm theo Quyết định số 3003/QĐ-BYT, ngày19 tháng 8 năm 2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế. Một người được xác định là nhiễm HIV khi có mẫu huyết thanh dương tính cả ba lần xét nghiệm kháng thể HIV, bằng ba loại sinh phẩm khác nhau với nguyên lý phản ứng và phương pháp chuẩn bị kháng nguyên khác nhau.
- Đồng nhiễm HCV/HIV khi bệnh nhân có đủ 2 tiêu chuẩn: Được chẩn đoán xác định nhiễm HIV và có kết quả xét nghiệm Anti HCV trong máu dương tính. - Các thông số men gan ALT, AST và Bilirubin toàn phần:
Các chỉ số bình thường: ALT: ≤ 40 UI/l -370
C; AST: ≤ 37 UI/L -370C; Bilirubin toàn phần: ≤ 17 µmol/L
- Giới hạn phát hiện có HCV trên máy COBAS: ≥ 38 copies/mL
2.5. Thời gian nghiên cứu: Từ 1/12/2010 đến 30/11/2011.
38
2.7. Xử lý số liệu
- Phân tích kiểu gen: Kết quả giải trình tự gen HCV được phân tích cho kết quả type HCV trên trang Web:
http://hcv.lanl.gov/content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html. - Phân tích phả hệ: Sử dụng chương trình MEGA5.1.
- Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê y học, sự khác biệt giữa hai tỷ lệ được đánh giá bằng thuật toán χ2
, sử dụng phần mềm STATA 10.0. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
39
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Từ 1 tháng 12 năm 2010 đến 30 tháng 11 năm 2011, chúng tôi thu thập được 108 mẫu máu của các bệnh nhân đến khám hoặc nằm điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương được xác định nhiễm viêm gan vi rút C mạn tính và có chỉ định làm xét nghiệm xác định kiểu gen của HCV.
3.1. Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu 3.1.1. Đặc điểm về tuổi 3.1.1. Đặc điểm về tuổi
Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân theo tuổi
Nhóm tuổi Số bệnh nhân % ≤ 30 17 15,74 31 - 40 47 43,52 41 - 50 19 17,59 >50 25 23,15 Tuổi trung bình 40,67 ± 9,94 Tuổi thấp nhất 22 Tuổi cao nhất 64
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tuổi trung bình là 40,67 ± 9,94, tuổi thấp nhất là 22 và tuổi cao nhất là 64 (Bảng 3.1). Theo nghiên cứu của tác giả Hồ Tấn Đạt và cs, tuổi trung bình của bệnh nhân nhiễm viêm gan C ở Việt nam là 47,90 ± 10,58 [4], còn trong nghiên cứu của tác giả Võ Minh Quang và cs độ tuổi trung bình là 51,7 ± 12 tuổi, nhỏ nhất là 19, cao nhất là 81 [12].
Bệnh viêm gan vi rút C là bệnh mạn tính, thường diễn biến thầm lặng, ít triệu chứng lâm sàng trong thời gian dài. Sở dĩ trong nghiên cứu của chúng tôi, tuổi trung
40
bình có thấp hơn so với các nghiên cứu khác, vì đối tượng nghiên cứu đa số là những bệnh nhân khám sức khỏe định kỳ và vô tình phát hiện nhiễm vi rút viêm gan C hoặc những bệnh nhân vào viện do bệnh khác và được xét nghiệm vi rút viêm gan C. Điều này cũng phù hợp với mức độ suy gan của các bệnh nhân trong nghiên cứu