4. Sản phẩm của đề tài
2.1.2. Tiêu chuẩn hố nguyên liệu
2.1.2.1.Nguyên liệu nghiên cứu
Bảng 2.1: Mẫu nguyên liệu
Mẫu địa điểm thu mẫu Thời gian thu mẫu
Hồng kỳ (Radix Astragali) và Diệp hạ châu (Herba Phyllanthi
urinariae)
Cơng ty Hồng đài Việt VIET ROSELLE Co.LTD. địa chỉ
188/117/13 Tơn Thất Thuyết- Quận 4- Tp. Hồ Chắ Minh.
Tháng 3 năm 2007
Xử lý nguyên liệu: Dược liệu sau khi thu hái được để khơ tự nhiên ở nơi thống mát, băm nhỏ, xay thành bột. Bảo quản trong lọ nhựa kắn.
2.1.2.2. Hĩa chất
Anhydric acetic (Ac2O)
Acid Sulfuric (H2SO4) Chloroform(CHCl3) Cồn 400 Dietylete (C2H5-C2H5) Methanol (CH3OH) n-Butanol(n-BuOH)
2.1.2.3. Trang thiết bị
Bình ngấm kiệt
Cân phân tắch điện tử CE- Mettle Toledo
Dụng cụ cơ cách thủy Memmer
Máy cơ quay giảm áp BUCHI
Tủ sấy thường Memmert và tủ sấy chân khơng
đèn soi UV-DESAGA SARSTEDT GRUPPE
Bình hút ẩm
Nhiệt kế
2.1.2.4. Tiêu chuẩn hĩa nguyên liệu
Phương pháp xác định độ ẩm: (Dược điển Việt Nam III , 2002, PL 5.16) độ ẩm của nguyên liệu và và cao được xác định bằng phương pháp sấy.
Nguyên tắc
đem dược liệu sấy ở 1050C, nước trong dược liệu sẽ bốc hơi làm giảm khối lượng dược liệu. Cân dược liệu sau khi nước đã bốc hơi hết rồi suy ra độ ẩm của dược liệu
Tiến hành
Sấy chén khối lượng khơng đổi. Cân chắnh xác khoảng 1,5 g dược liệu vào chén. Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C trong hai giờ. Dùng kẹp lấy chén đựng dược liệu ra đặt vào bình hút ẩm 15 phút, Cân tắnh kết quả.
độẩm nguyên liệu:
a - b
X= x 100
a
a : Lượng dược liệu chưa sấy b: Lượng dược liệu sau khi sấy
2.1.3. định tắnh thành phần hĩa học
2.1.3.1. Hồng kỳ
định tắnh
Bản mỏng: Silicagel G dày 0,25mm, hoạt hĩa ở 1100C trong 1 giờ.
a) Pha dung dịch thử:
Lấy 3 gam bột dược liệu, thêm 20ml methanol, đun sơi hồi lưu 1 giờ, để
nguội, lọc. Dịch lọc cho chảy qua một cột sắc ký đã được nhồi 5g ơxyt nhơm trung tắnh. Phản hấp phụ bằng 100ml methanol 40% , làm bốc hơi dịch lọc trên cách thủy
đến khơ. Cắn được hịa trong 30ml nước rồi được chiết bằng n-butanol đã bảo hịa nước 2 lần, mỗi lần 20ml, loại bỏ nước rửa, bốc hơi dịch chiết n-butanol trên cách thủy đến khơ. Hịa cắn trong 0,5ml methanol, được dung dịch thử.
b) Pha dung dịch đối chiếu
Hịa tan chất Astragalosid IV trong methanol để được dung dịch đối chiếu cĩ nồng độ 1mg/1ml.(Nếu khơng thì lấy 3 gam bột Hồng kỳ chuẩn rồi tiến hành như
pha dung dịch thử)
c) Tiến hành chấm riêng rẽ 2 dịch chiết lên bản mỏng. Sau khi triển khai, lấy ra đểở nhiệt độ phịng. Phun thuốc hiện màu là dung dịch axit sunfuric 10% trong ethanol. Sấy ở 1050C trong 5 phút. So sánh các giá trị Rf của 2 mẫu.
2.1.3.2.Diệp hạ châu
định tắnh (DđVN. phụ lục 4.4)
a. Lấy 5 gam dược liệu khơ, tán nhỏ, thêm 50ml ethanol 90%, lắc đều rồi đun cách thủy 30 phút, cơ cạn cịn 3-4ml, chia đơi dịch lọc vào 2 ống nghiệm :
Ống 1: thêm 4-5 giọt axit chlohydric đậm đặc , rồi thêm vào 1 ắt bột Zn, xuất hiện màu đỏ.
Ống 2: thêm 2-3 giọt FeCl3, xuấthiện màu xanh tắm.
b. Lấy 0,5 gam bột dược liệu, thêm 10ml nước, đun sơi, lọc, lấy 2-3ml dịch lọc để nguội, thêm 1-2 giọt gelatin 2%, xuất hiện vẫn đục.
c. Sắc ký lớp mỏng
Bản mỏng: Silicagel G dày 0,25mm. hoạt hĩa ở 1100C trong 1 giờ.
Dung mơi khai triển: Ethyl acetat Ờ Methanol Ờ Nước Ờ Ammoniac (100:17:13:3)
Tiến hành:
a. Pha dung dịch thử: Làm ẩm khoảng 2 gam bột dược liệu thơ bằng ammoniac đậm đặc, để yên trong 30 phút, thêm 20ml chloroform, ngâm 60 phút
thỉnh thoảng lắc. Lọc rứa cắn với 5ml chlroform, gộp nước rửa và dịch lọc, bốc hơi trên cách thủy tới khơ. Hịa cắn bằng 1ml chloroform, ta thu được dịch thử.
b. Pha dung dịch đối chiếu: dùng 2 gam bột Diệp hạ châu, tiến hành chiết như pha chế dung dịch thử.
c. Chấm sắc ký: Chấm riêng biệt 2 vết của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Cho vào bình sắc ký. Sấy bản mỏng ở 600C cho biết ammoniac. Phun thuốc thử Dragendorfi Rf của mẫu thử phải giống như mẫu đối chiếu. 2.1.4. Bào chế Chiết xuất Diệp hạ châu Thành phần - Diệp hạ châu 6,5kg - Cồn 40% 39 lắt
Chiết xuất theo nguyên tắc chiết xuất ngược dịng, dịch cồn chiết xong được cơ cách thủy cịn 2 lắt, lọc lấy dịch trong , thêm nước cho đủ 2 lắt (DD1).
Chiết xuất Hồng kỳ
Hồng kỳ 3,5kg nấu cao 3 lần, lần thứ nhất đổ nước ngập mặt dược liệu khoảng 10cm, dùng vỉ gài cho dược liệu khơng nổi lên trên, nấu sơi khoảng 3 giờ, gạn dịch 1, lần thứ hai đổ nước xâm xấp mặt dược liệu đun sơi 2 giờ, gạn lấy dịch 2, lần thứ 3 đổ nước xâm xấp mặt dược liệu đun sơi 1 giờ, gạn lấy dịch 3. Phối hợp dịch 1, 2, 3. Cơ cách thủy cịn 1 lắt. Lọc trong, thêm nước cho đủ 1 lắt (DD2)
Phối hợp DDl và DD2. Bảo quản bằng natri benzoat 0,4 %
đĩng ống uống 10ml, tiệt trùng 1100 C trong autoclave.
2.1.5 Yêu cầu chất lượng
Tắnh chất
Chất lỏng sánh, màu nâu đen, mùi thơm đặc trưng, vịđắng.
độ trong và độđồng nhất.
Chất lỏng sánh, đồng nhất, khơng được cĩ váng mốc, bã dược liệu và vật lạ.
Tỷ trọng
Ở nhiệt độ 250 C, đo bằng bình đo tỷ trọng picnomet, tỷ trọng từ 1,0580 đến 1,0590.
Trọng lượng cắn khơ khơng dưới 12,2 % (KL/TT)
Sai số thể tắch.
Thể tắch : 10mlổ10% (10,0-11,0 ml)
định tắnh
Phải cĩ phản ứng alkaloidcủa Diệp hạ châu và saponin của Hồng kỳ.
độ nhiễm khuẩn Phải đạt mức 4- DđVN III Ờ Phụ lục 10.7. đĩng gĩi Ờ Bảo quản Ờ hạn dùng đĩng gĩi : ống uống 10ml, hộp 30 ống Bảo quản : nơi khơ mát Hạn dùng : 24 tháng kể từ ngày sản xuất. 2.1.6. Phương pháp kiểm nghiệm : 2.1.6.1. Tắnh chất
Kiểm tra bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các tắnh chất đã nêu.
2.1.6.2. độ trong và độđồng nhất
Cho cao thuốc vào ống nghiệm lớn để yên, quan sát bằng mắt thường, dung dịch phải trong và đồng nhất, khơng cĩ váng mốc đĩng cặn.
2.1.6.3. Tỷ trọng
đo ở nhiệt độ 250 C (Phụ lục 5.15)
Cân chắnh xác picnomet rỗng, khơ và sạch. đổ vào picnomet mẫu thử, chú ý khơng để cĩ bọt khắ. Dùng giấy lọc thấm hết dung dịch thừa trên vạch mức. Làm khơ mặt ngồi của picnomet, cân và tắnh trọng lượng mẫu thử chứa trong picnomet. Tiếp sau đĩ dổ mẫu thử ra, rửa sạch picnomet và làm khơ bằng cách tráng ethanol rồi aceton, thổi khơng khắ nĩng đuổi hết aceton. Cho nước cất vào picnomet, sau đĩ xác định khối lượng nước cất chứa trong picnomet ở nhiệt độ 250 C. Tỷ số giữa khối lượng mẫu thử và khối lượng nước cất thu được là tỷ trọng mẫu thửở nhiệt độ 250 C.
2.1.6.4. Cắn sau khi bay hơi:
Hút chắnh xác 10ml cao thuốc, vào một chén sứ đã được sấy khơ đến khối lượng khơng đổi, cân bì. Dịch thuốc được cơ bằng cách thủy đến cạn, sấy 100- 1050
C trong 3 giờ đến khối lượng khơng đổi, cho vào bình hút ẩm đến nguội, cân khối lượng cắn. Tắnh khối lượng cắn khơ cho 100ml thuốc theo cơng thức:
X% = (A-B) x 10
A: khối lượng chén và cắn khơ B: khối lượng chén khơng
2.1.6.5. Sai số thể tắch
Thử theo DđVN III - Phụ lục 8.1
Lấy 5 ống thuốc, xác định thể tắch bằng ống đong chuẩn, sạch và khơ cĩ độ
chắnh xác phù hợp. Thể tắch mỗi đơn vị phải nằm trong giới hạn cho phép.
2.1.6.6. định tắnh
Diệp hạ châu
1. Dụng cụ và thuốc thử:
- Bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F254 đã hoạt hĩa ở 1100 C trong 1 giờ. - Dung dịch mẫu đối chiếu Diệp hạ châu: Lấy 4g bột dược liệu, làm ẩm
bằng dung dịch ammoniac đậm đặc trong 2 giờ. Thêm 20ml cloroform siêu âm 15 phút hoặc ngâm 60 phút. Lọc, rửa cắn với 5ml cloroform. Gộp dịch cloroform, để bay hơi tự nhiên đến cạn, thêm 1 ml cloroform để dược dung dịch chấm sắc ký.
- Dung dịch mẫu: Lấy 20ml cao thuốc, thêm dung dịch ammoniac đậm đặc
đến pH 9, để yên một đêm. Lắng với cloroform, gạn lấy dịch cloroform để
bay hơi tự nhiên đến cạn, thêm 1ml cloroform đểđược dung dịch chấm sắc ký.
- Hệ dung mơi khai triển:
Ethyl acetat Ờ Methanol Ờ Nước Ờ Amoniac (100:11:13:3). - Thuốc thử phát hiện: dung dịch Dragendorff.
2. Cách tiến hành:
- Chấm vạch trên bản mỏng. để khơ ở nhiệt độ phịng, cho vào bình sắc ký
đã được bảo hồ dung mơi trước đĩ.
- Sau khi triển khai xong, lấy bản mỏng ra, đểở nhiệt độ phịng cho bay hơi hết dung mơi. Phun thuốc thử Dragendorff, alkaloid cho màu cam với thuốc thử trên.
- Kết quả: Mẫu thử phải cĩ vết cùng màu và Rf tương đương với vết của mẫu đối chiếu Diệp hạ châu.
Hồng kỳ:
1. Dụng cụ và thuốc thử:
- Bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F254 đã hoạt hĩa ở 1100 C trong 1 giờ. - Dung dịch mẫu đối chiếu Hồng kỳ: Cân 5g Hồng kỳ, chiết nĩng hồi lưu
bằng 20 ml methanol 70% khoảng 1giờ, lắc với n- buthanol, dịch n- buthanol được rửa bằng nước cất. Bốc hơi dịch n - buthanol trên cách thủy
đến khơ, hồ cắn trong 1ml methanol đểđược dung dịch chấm sắc ký. - Dung dịch mẫu thử: Lấy 10ml cao thuốc, chiết bằng n - buthanol, dịch n -
buthanol được rửa bằng nước cất. Bốc hơi dịch n - buthanol trên cách thuỷ
đến khơ, hồ cắn trong 1ml methanol đểđược dung dịch chấm sắc ký. - Hệ dung mơi khai triển: Cloroform Ờ Methanol (9:1)
- Thuốc thử phát hiện: Vanilin 1%/ cồn tuyệt đối/ acid sulfuric 10%/ cồn tuyệt đối (1/1) (cách pha: 1g Vanilin trong 100 ml cồn tuyệt đối [DD1], 10 ml acid sulfuric đậm đặc trong 100 ml cồn tuyệt đối [DD2] . Khi dùng phối hợp đồng lượng DD1 và DD2. Bảo quản DD1 trong tủ lạnh)
2. Cách tiến hành:
- Chấm vạch trên bản mỏng. để khơ tự nhiên, cho vào bình sắc ký đã được bảo hồ dung mơi trước đĩ.
- Sau khi triển khai xong, lấy bản mỏng ra, để nhiệt độ phịng cho bay hơi hết dung mơi. Phun thuốc thử Vanilin Sulfuric, sấy bản mỏng ở nhiệt độ
100- 1050C trong 5 phút, các vết saponin cho màu tắm với thuốc thử trên. - Kết quả: Mẫu thử phải cĩ vết cùng màu và Rf tương đương với vết của
mẫu đối chiếu Hồng kỳ
2.1.6.7. độ nhiễm khuẩn:
Tiến hành cấy vào mơi trường thửđộ nhiễm khuẩn và nấm mốc đã ghi trong DđVN III- phụ lục 10.7. Cao thuốc phải đạt mức 4 theo yêu cầu qui định về độ
nhiễm khuẩn cho các chế phẩm dùng uống
2.2. THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG LÂM SÀNG
Thử nghiệm lâm sàng cĩ đối chứng ngẫu nhiên được tiến hành theo phương pháp mù đơi (double - blind) trên 2 lơ gồm: 44 bệnh nhân uống chế phẩm HK - DHC và 42 bệnh nhân uống chế phẩm DHC. 86 bệnh nhân trên sẽđược uống thuốc liên tục từ 16 tuần đến 104 tuần với liều 30ml mỗi ngày, chia làm 3 lần, mỗi lần 10ml trước khi ăn.
Theo các tài liệu [6],[44],[54] tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh HBeAg của các loại Diệp hạ châu là 20%. để chế phẩm Hồng kỳ Ờ Diệp hạ châu cĩ tỷ lệ chuyển
đổi huyết thanh hơn lơ chứng (Diệp hạ châu) là 25% (RR = 2,25). để 80% khả năng này đúng với độ tin cậy 95%, cỡ mẫu phải đạt: {Z(1- α) √ [2P*(1ỜP*)] + Z(1Ờ β) √[P1(1ỜP1)+P2(1-P2)]}2 n = (P1 Ờ P2)2 với P1 = 0,45 Z(1- α) = 1,64 RR = P1 / P2 P2 = 0,2 Z(1Ờ β ) = 0,84 P* = (P1 + P2) / 2 n = 43
Mẫu nghiên cứu được chọn ngẫu nhiên hệ thống, do một người duy nhất thực hiện.
để thực hiện Ộmù đơiỢ, thuốc nghiên cứu được bào chế cĩ dạng hồn tồn giống nhau (cao nước đựng trong ống thủy tinh 10 ml, toa nhãn giống nhau). Những lơ bào chế và cấp thuốc điều trịđã được qui định ngẫu nhiên từ trước, bệnh nhân và nhân viên y tế (điều dưỡng, bác sỹ điều trị, nhà nghiên cứu khi tắnh tốn thống kê) dù biết lơ nào là A, lơ nào là B nhưng lại khơng biết lơ nào uống thuốc gì.
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh:
Ớ Bệnh nhân hợp tác
Ớ Tuổi từ 18 Ờ 60
Ớ Cĩ HBsAg (+) trên 6 tháng
Ớ Cĩ ALT ≥ 2 lần trị số bình thường giới hạn cao (≥ 80U/L)
Ớ Anti HCV (-)
Ớ Khơng dùng các dược phẩm hĩa trị cũng như các dược phẩm chiết xuất từ thảo mộc cĩ tác dụng kháng virus hoặc tác dụng điều hịa miễn dịch liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh viêm gan B trong vịng 1 tháng cũng như các dược phẩm cĩ tác dụng cải thiện men gan trong vịng 2 tuần trước đĩ.
2.2.3. Tiêu chuẩn lọai trừ:
Ớ Nghiện rượu
Ớ Bệnh nhân điều trị khơng liên tục hoặc tự ý dùng thêm thuốc mà khơng hỏi ý kiến của bác sĩ ..
2.3. PHƯƠNG TIỆN
2.3.1. Chế phẩm nghiên cứu.
2.3.1.1. Thuốc nước Hồng kỳ- Diệp hạ châu .
Cơng thức điều chế cho 30ml cao thuốc (liều dùng cho một người trong một ngày)
Diệp hạ châu (Herba Phyllanthi urinariae) 65g
Hồng kỳ(Radix Astragali) 35g Natri benzoat 0,4% Bào chế Chiết xuất Diệp hạ châu Thành phần Diệp hạ châu 6,5kg Cồn 40% 39 lắt
Chiết xuất theo nguyên tắc chiết xuất ngược dịng, dịch cồn chiết xong được cơ cách thủy cịn 2 lắt, lọc lấy dịch trong, thêm nước cho đủ 2 lắt (DD1).
Chiết xuất Hồng kỳ
Hồng kỳ 3,5kg nấu cao 3 lần, lần thứ nhất đổ nước ngập mặt dược liệu khoảng 10cm, dùng vỉ gài cho dược liệu khơng nổi lên trên, nấu sơi khoảng 3 giờ, gạn dịch 1, lần thứ hai đổ nước xâm xấp mặt dược liệu đun sơi 2 giờ, gạn lấy dịch 2, lần thứ 3 đổ nước xâm xấp mặt dược liệu đun sơi 1 giờ, gạn lấy dịch 3. Phối hợp dịch 1, 2, 3. Cơ cách thủy cịn 1 lắt. Lọc trong, thêm nước cho đủ 1 lắt (DD 2)
đĩng ống uống 10ml, tiệt trùng 1100 C trong autoclave. Yêu cầu chất lượng Tắnh chất
Chất lỏng sánh, màu nâu đen, mùi thơm đặc trưng, vịđắng.
độ trong và độđồng nhất.
Chất lỏng sánh, đồng nhất, khơng được cĩ váng mốc, bã dược liệu và vật lạ.
Tỷ trọng
Ở nhiệt độ 250 C, đo bằng bình đo tỷ trọng picnomet, tỷ trọng từ 1,0580 đến 1,0590.
Cắn sau khi bay hơi
Trọng lượng cắn khơ khơng dưới 12,2 % (KL/TT)
Sai số thể tắch.
Thể tắch : 10mlổ10% (10,0-11,0 ml)
định tắnh
Phải cĩ phản ứng của alkaloid của Diệp hạ châu và saponin của Hồng kỳ
độ nhiễm khuẩn Phải đạt mức 4- DđVN III Ờ Phụ lục 10.7. đĩng gĩi Ờ Bảo quản Ờ hạn dùng đĩng gĩi : ống uống 10ml, hộp 30 ống Bảo quản : nơi khơ mát Hạn dùng : 24 tháng kể từ ngày sản xuất.
Liều dùng/ ngày: ngày uống 1 ống (10ml) x 3 lần; (tương đương với 35g Hồng kỳ/ ngày và 65g Diệp hạ châu/ ngày). Uống liên tục trong 24 tháng dựa vào các khuyến cáo về thời gian điều trị của IFN trên bệnh nhân nhiễm HBV cĩ HBeAg (+) hoặc cĩ HBeAg(-)[1]
2.3.1.2. Thuốc nước Diệp hạ châu
Cơng thức điều chế cho 30ml cao thuốc (liều dùng cho một người trong một ngày)
Diệp hạ châu (Herba Phyllanthi urinariae) 65g
Natri benzoat 0,4%
Chiết xuất Diệp hạ châu Thành phần Diệp hạ châu 6,5kg Cồn 40% 39 lắt
Chiết xuất theo nguyên tắc chiết xuất ngược dịng, dịch cồn chiết xong được cơ cách thủy cịn 2 lắt, lọc lấy dịch trong, thêm nước cho đủ 3 lắt. Bảo quản bằng