4. MỘT SỐ MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG AN THẦN GIẢI LO ÂU
3.3.5 Kết quả thử nghiệm độc tính bán trƣờng diễn
Trong suốt thời gian thí nghiệm, chuột ở cả 3 lô (1 lô chứng và 2 lô thử nghiệm) đều hoạt động bình thƣờng, nhanh nhẹn, lông mƣợt, mắt sáng, ăn uống
tốt, phân khô, không thấy bất kỳ biểu hiện gì đặc biệt ở cả 3 lô chuột trong suốt 8 tuần nghiên cứu.
Sau 8 tuần uống cao chiết Lạc tiên tây 2 liều 150mg/kg chuột và 300mg/kg chuột, tất cả các xét nghiệm đánh giá chức năng tạo máu (số lƣợng hồng cầu, hàm lƣợng hemoglobin, số lƣợng bạch cầu) không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng và giữa các thời điểm trƣớc và sau khi uống thuốc ( p > 0,05). Quan sát đại thể sau 8 tuần uống cao chiết Lạc tiên tây liều 300mg/kg chuột và liều 600mg/kg chuột: Giải phẫu tất cả các lô để quan sát đại thể các tạng phủ của chuột, không thấy bất kỳ thay đổi bệnh lý nào về hình thái đại thể của các cơ quan tim, gan, thận, bàng quang và hệ tiêu hóa.
Chỉ số ure và creatin của 1 lô LTT150 và LTT300 khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng. Có 1/5 mẫu thận có biểu hiện viêm thận kẽ mạn ở cả hai liều thử nghiệm.
Bảng 3.15: Chỉ số huyết học, sinh hóa của chuột nhắt sau 60 ngày dùng thuốc
Chỉ số Chứng LTT150 LTT300 Hồng cầu (triệu/mm3) 9,19 ± 2,1 6,99 ± 2,7 76,06% 7,46 ±2,4 81,17% Bạch cầu (triệu/mm3) 9,55 ± 0,4 9,41 ± 2,0 98,53% 9,46 ± 2,0 99,05% Hb (%) 152 ± 11,2 146,56 ± 32,4 96,42% 142,11 ± 32,8 93,49% Ure (mg/dL) 11,64 ±2,0 13,99 ± 2,4* 120,2% 14,54 ± 2,4* 124,9% Creatin (mg/dL) 67,0 ± 4,3 74,67 ± 8* 111,4% 68,11 ± 3,9 101,6%
AST (U/L) 132,67 ±41,5 113,22 ± 17,0 85,33% 117,33 ± 23,0 88,43% ALT (U/L) 94,11 ± 38,9 76,00 ± 12,0 80,76% 77,67 ± 16,0 82,53% Ghi chú: * Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,05)
a. thận bình thƣờng b. viêm thận kẽ mãn c. Gan bình thƣờng
Hình 3.17 Hình ảnh mô học gan thận chuột nhắt trắng sau 8 tuần uống thuốc lô thử nghiệm
a. Tế bào thận bình thƣờng b. Tế bào gan bình thƣơng
Hình 3.18 Hình ảnh mô học gan thận lô chứng
Nhận xét chung
Dƣợc liệu sử dụng trong nghiên cứu đạt yêu cầu về độ tinh khiết (độ ẩm, độ tro) và các tính chất lý hóa cơ bản thông qua các phản ứng định tính hóa học, sắc ký lớp mỏng, đã xác định sự hiện diện của các flavonoid và vitexin trong mẫu nghiên cứu. Định lƣợng bằng phƣơng pháp cân và phƣơng pháp quang phổ đã xác định hàm lƣợng flavonoid toàn phần là 0,986 % và flavonoid tính theo vitexin là 0,617 %. Đây là những tiền đề cần thiết để tiến hành các thử nghiệm về tác dụng dƣợc lý thực nghiệm và lâm sàng tiếp theo.
Về phƣơng pháp chiết xuất
Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng, định lƣợng flavonoid toàn phần, và định lƣợng vitexin cho thấy ngâm kiệt với dung môi cồn 60 % trong điều kiện nhiệt độ thƣờng đã chiết xuất đƣợc gần nhƣ toàn bộ các hoạt chất nhóm flavonoid, trong đó có vitexin. Đây là phƣơng pháp chiết xuất đơn giản, dễ triển khai ở các quy mô sản xuất nhỏ và lớn.
Về tính an toàn của cao Lạc tiên tây
Trong thử nghiệm độc tính cấp, liều cao nhất có thể đƣa thuốc qua kim đầu tù là 3,2 g cao thuốc / kg chuột (tƣơng đƣơng liều ở ngƣời là 14,88 g/kg, tƣơng đƣơng 44,4 g dƣợc liệu). Ở liều này, thuốc ở dạng hỗn dịch rất đậm đặc vừa đủ qua đầu kim để có thể bơm thuốc vào dạ dày chuột. Sau khi uống thuốc, chuột vẫn ăn uống, hoạt động và bài tiết bình thƣờng, không có biểu hiện ngộ độc ở chuột và không có chuột nào chết trong vòng 72 giờ và suốt 2 tuần tiếp theo sau khi uống thuốc. Mặc dù chƣa xác định đƣợc độc tính cấp và chƣa tính đƣợc LD50 của cao Lạc tiên tâu, nhƣng từ liều Dmax = 3,2 g/kg chúng tôi đã chọn đƣợc 2 liều cho các thử nghiệm dƣợc lý tiếp theo là 150 mg/kg (tƣơng dƣơng 1/20 Dmax) và 300 mg/kg (tƣơng đƣơng 1/10 Dmax).
Sau 2 tháng uống cao chiết Lạc tiên tây hai liều LTT150 và LTT300, các chỉ số hồng cầu, bạch cầu, Hb, AST, ALT, cấu trúc vi thể gan của chuột không khác biệt so với nhóm uống nƣớc cất. Tuy nhiên, chỉ số ure tăng 20,2 %, creatinin tăng 11,14% và có 1/5 chuột ở cả hai lô thử nghiệm LTT150 và LTT300 bị viêm thận kẽ mạn. Cần có những nghiên cứu kỹ lƣỡng hơn để đánh giá về tính an toàn với chức năng thận của dƣợc liệu này. Trong đó, cần chú trọng những nghiên cứu về liều dùng tối ƣu của Lạc tiên tây.
Về tác dụng an thần, giải lo âu của cao Lạc tiên tây
Với mục tiêu nghiên cứu của đề tài là khảo sát tác dụng an thần của Lạc tiên tây, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tác dụng hiệp đồng thiopental (40 mg/kg, IV) theo mô hình của các nghiên cứu trƣớc đây [44], [45] ,[15], [26]. Loại barbituric có thời gian bán thải ngắn nên dùng đƣợc để khảo sát tác dụng hiệp lực kéo dài thời gian ngủ của các thuốc an thần gây ngủ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, LTT300 sau uống 60 phút đã kéo dài thời gian ngủ mê của chuột có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
Với mục tiêu nghiên cứu tác dụng an thần giải lo âu, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm trên mô hình chữ thập nâng cao, đây là mô hình khá đơn giản và đƣợc áp dụng trong nhiều nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc [46]
với thuốc đối chiếu là Diazepam (2 mg/kg, uống). Kết quả cho thấy số lần ra nhánh mở và lƣu lại nhánh mở của chuột uống diazepam khá tƣơng đồng với những công bố trƣớc đây của tác giả trong và ngoài nƣớc. Đồng thời, với 2 liều nghiên cứu LTT150 và LTT300 Lạc tiên tây đều làm tăng số lần ra nhánh mở và tăng thời gian lƣu lại tại nhánh mở của chuột thử nghiệm có ý nghĩa thống kê. Đây là những cơ sở đáng tin cậy để chứng minh tác dụng an thần giải lo âu của cao chiết từ Lạc tiên tây trống tại Việt Nam.
Đồng thời, để khẳng định lại tác dụng an thần giải lo âu, chúng tôi cũng tiến hành thử nghiệm trên mô hình đen trắng, đây cũng là mô hình đƣợc áp dụng trong nhiều nghiên cứu trong và ngoài nƣớc cũng với thuốc đối chiếu là Diazepam (2 mg/kg , uống ). Kết quả cho thấy, số lần chuột ra ngăn sáng tăng nhƣng không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ( p > 0,05) và thời gian chuột lƣu lại ngăn sáng của lô DZP tăng 16,52 % và lô LTT150 tăng 19,58 % có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ( p < 0,05). Kết quả này cũng là cơ sở đáng tin cậy để chứng minh tác dụng an thần giải lo âu của cao chiết từ Lạc tiên tây.
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận
- Đã khảo sát một số tiêu chuẩn hóa lý của dƣợc liệu Lạc tiên tây trồng tại Việt Nam: độ ẩm (8,982 %), tro toàn phần (0,149 %), tro không tan trong acid hydro cloric (0,006 %), định tính flavonoid, alkaloid bằng phƣơng pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng, flavonoid toàn phần (0,986 %), vitexin (0,617 %).
- Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng của cao Lạc tiên tây: độ ẩm (17,67 % ), tro toàn phần (0,216 %), định tính flavonoid, alkaloid bằng phƣơng pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng, flavonoid toàn phần (2,882 %), vitexin ( 2,087 %).
- Ở liều uống LTT300, cao cồn Lạc tiên tây có tác dụng kéo dài thời gian ngủ của Thiopental (40 mg/kg, IV).
- Với thử nghiệm mô hình chữ thâp nâng cao, ở liều uống LTT150 và LTT300 , cao cồn Lạc tiên tây thể hiện tác dụng an thần giải lo âu trên chuột nhắt trắng.
- Tác dụng trên mô hình đen trắng , ở liều LTT150 làm tăng thời gian chuột lƣu lại ngăn sáng, khẳng định liều này có tác dụng an thần giải lo âu.
- Đã xác định Dmax đƣờng uống trên chuột nhắt trắng là 3,2 g/kg
- Ở liều LTT150 và LTT300, uống 60 ngày, cao Lạc tiên tây không làm thay đổi số lƣợng hồng cầu, bạch cầu, hemoglobin, AST, ALT, vi thể gan, nhƣng làm tăng chỉ số ure, creatinin và thay đổi hình thái vi thể mô học thận của chuột nhắt trắng ở hai lô thử nghiệm LTT150 và LTT300.
4.2. Đề nghị
- Bảng tiêu chuẩn cơ sở Lạc tiên tây
STT Các tiêu chí Mức chất lƣợng
1 Soi bột Lỗ khí, mạch chấm đồng tiền, mảng biểu bì, lông che chở, mảnh nhựa calci oxalat, mạch vạch, mạch mạng, lông tiết
2 Độ ẩm Không đƣợc quá 10 %
3 Độ tro toàn phần Không đƣợc quá 2 % 4 Độ tro không tan trong
acid HCl Không đƣợc quá 2 % 5 Định tính: 1. Phản ứng hóa học 2. Sắc ký lớp mỏng
Dƣợc liệu phải cho phản ứng với : o Bột Mg và HCl có màu đỏ cam o Thuốc thừ Mayer o Thuốc thử Bouchardat o Thuốc thử Dragendorff Các vết thu đƣợc trên sắc kí đồ của dƣợc liệu phải có giá trị Rf và màu sắc tƣơng đồng với vết thu đƣợc của chuẩn vitexin
6 Định lƣợng Hàm lƣợng flavonoid toàn phần theo phƣơng pháp cân
0,9%
Hàm lƣợng flavonoid toàn phần tính theo vitexin 0,6% - Bảng tiêu chuẩn cơ sở cao Lạc tiên tây
STT Các tiêu chí Mức chất lƣợng
1 Độ ẩm Không đƣợc quá 20%
2 Độ tro toàn phần Không đƣợc quá 2% 3 Định tính:
3. Phản ứng hóa học
4. Sắc ký lớp mỏng
Cao phải cho phản ứng của hợp chất flavonoid Các vết thu đƣợc trên sắc
kí đồ của mẫu thử phải có giá trị Rf và màu sắc tƣơng đồng với vết thu đƣợc của
o Nguyên liệu Lạc tiên
o Chuẩn vitexin
4 Định lƣợng Hàm lƣợng flavonoid
toàn phần theo phƣơng pháp cân 2,8%
Hàm lƣợng flavonoid tính theo vitexin 2%
- Nghiên cứu liều tối ƣu có tác dụng an thần giải lo âu
- Nghiên cứu quy trình chiết xuất ở quy mô công nghiệp và dạng bào chế từ Lạc tiên tây
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Akhondzadeh S, naghavi HR, Vazirian M, et aL Passion flower in the treatment of generalized anxiety: a pilot double- blind randomized controlled trial with oaepamJ Clin pharm Ther. Oct 2001;26(5):363-367.
2. Asseessment report in Passiflora incarnate Lherba [ European Medicines Agency, 2008]
3. AKhon dzadeh S, Naghavi HR, Vazirian M, et aL Passiflora in the treatment ò
generalize anxiety: a pilot double blind randomized controlled trial with oaepam J Clin Pharm Ther. Oct 2001;26(5):363-367.
4. Borrelli F, Pinto L, Izzo Â, et aL Anti- inflammatory activity of Passiflora incarnate L in rats.Phytotherappy Res.1996;10:S104-S106.
5. Dhawan K, Kumar S, Sharma A. Anxiolytuc activity of aerial and underground
parts of Passiflora incarnate. Fitoterapia.Dec 2001;72(8):922-926.
6. Đào Trần Thái, bộ môn Tâm Thần học, ĐH Y-Dƣợc TPHCM(2003), Tâm thần
học, NXB Y Học,tr78- 104.
7. Dhawan K, Kumat S, Sharma A. Anti anxiety studies on extracts of Passiflora
incarnate Linneaus.J EthnopharmacoL Dec 2001;78(2-3):165-170.
8. Elsas S-M, Rossi DJ, Raber J, et aL Passiflora incarnate L (passionflower) extract elicit GABA currents in hippocxampal neurons in vitro and show anxiogenic and anticonvulsant effects on vivo, vary with extraction method.
Phytomedicine .2010 Oct;17(12):940-9.
9. Elsas S-M, Rossi DJ, Raber J, et aL Passifloran incarnate L (Passionflower) extract elicit GABA currents in hippocampal neurons in vitro and show
anxiogenic and anticonvulsant effects in vivo, varying with extraction method.
Phytomedinine.2010 Oct; 17(12):940-9.
10. Fisher AA, Purcell P, Le Couteur DG. Toxicity of Passiflora incarnate L J Toxicol clin ToxicoL 2000;38(1):63-66.
11. Grice ID, Ferreira LA, Griffiths LR Identification and Simultaneous analysis of harmane, harmine, harmol, isovitexn, and vitexin in Passiflora incarnate extracts with a novel hplc method.J Liq Chrom Rel Technol 2011;24(16):2513- 2523.
12. Grundmann O, Wang J, McGregor GP, et aL Anxiolytic Activity of a Phytochemically Characterized Passiflora incarnate Extract is Mediated Via the GABAergic System Planta Med.2008 Dec ;74(15):1769-73.
13. Holbrook AM, Croether R, Lotter A, Cheng C, King D (2000), “ Metanalysis of benzodoazepam use in the treatment of insomnia” CMAJ; VoL162, pp. 225- 33.
14. Lori A.Panossia, Alon Y. Avidan (2009), “ Review of sleep Disorders,” Med Clin N Am, VoL 93, pp. 407 – 425.
15. Maribel Herrera-Ruiz, Yolanda García-Beltrán, Sergio Mara, Gabriela Díaz- Vesliz, Glauce S.B. Viana, Jaime Tortoriello, Guillermo Ramirez(2006), “ Antidepressant and anxiolytic effects ò hydroalcoholic extract from Salvia elegans” Journal ò Ethnopharmacology, VoL107,pp.53-58.
16. Morin CM, Hauri PJ, Espie CA, Spielman Ạ, Buysse DJ, Bootzin RR(1999), “ Nonpharmacologic treatment of chronic insomnia.An Ameri – can Academy of sleep Medicine review” ,sleep, VoL22, pp.1134-56.
17. Marcenac F, Jin GZ Go non F (1986), “ effect of L- tetrahydropalmatine on dopamine release and metabolism in the rat striatum”, Psychopharmacology (Berl), VoL 89(1), pp. 89-93.
18. Miyasaka LS, Atallad AN, Soares BG. Passiflora for anxiety disorder. Cochrane Database Syst Rev.2007(1):CD004518.
19. Movafegh A, Alizadeh R, Hajimohamadi F, et al .Preoperative oral Passiflora
incarnate Reduces anxiety in ambulatory surgery patient: a doubke blind, placebo controlled study. Anesth. Jun 2008;106(6):1728-1732.
20. Morin CM, Hauri PJ, Espie CA, Spielman Ạ, Buysse DJ, Bootzin RR(1999), “ Nonpharmacologic treatment of chronic insomnia. An Ameri – can Academy of sleep Medicine review”, sleep,VoL22,pp.1134-56.
21. Ngô Anh Dũng (2008), Y lý Y học cổ truyền, Nhà xuất bản Y học,tr.62-78.10 22. Nguyễn Văn Hùng, Hoàng Tích Huyền (1989). “ Đánh giá tác dụng an thần của
cao lá sen, tâm sen, lá vông và củ bình vôi trên súc vật thử nghiệm” Y học thực hành, Số 5 (tập 282),tr.28- 29.
23. Nguyễn Lan Thùy Ty, Võ Phùng Nguyên, Nguyễn Hữu Đức (2008), “ Đánh giá tác dụng an thần – gây ngủ của 2 chế phẩm có nguồn gốc dƣợc liệu “ Y Học TP HCM, tập 12(2), tr 106-111.
24. Nguyễn Thiên Quyến, Đào Trọng Cƣờng (2003), Chẩn đoán phân biệt chứng trạng trong đông y, Xí nghiệp in Bến Thành, tr 298-306.
25. Nguyễn sơn Tùng, Nguyễn Ngọc Khôi ( 2008) , “ khảo sát mô hình và nghiên cứu tác dụng giải lo âu của một số phối hợp dƣợc liệu “ , Y Học TP. Hồ Chí Minh, tập 41, số 1.
26. Newall CA, Anderson LA, Philipson JD.Herbal Medicines:A Guide for health-
Care ProfessionaL 1st ed.London: Pharmaceutic Press;1996.
27. Nguyễn Thiên Quyến (1998), Chẩn đoán phân biệt chứng hậu trong đông y, Xí nghiệp in trƣờng đại học kỹ thuật TP HCM, tr.232-236,302-307,492-497,646- 650.
28. Ohayon M(2002), “ Epidemiology of insomnia: what we know and we still need to learn:. Sleep Med Rev, VoL6,pp.97-111.
29. Pavan Kumar Reddy K. Bhagavan Rạu M, Sreedevi P., Pranali Pandit, Veena Rani I., Veena G .(2009), Phytochemical sdreening antiepileptic & analgesic activity of leaf extract of pasiflora foetida”, pharmacologyonline 3:pp. 576- 580.
30. PrutL, Belzung C.(2003),” The open field á a paradigm to measure the effects ò drug on anxiety – like behavios: a review”, Eur.J.PharmacoL,Vol463(1- 3),pp.3-33.
31. Phạm Hoàng Hộ(2003),Cây cỏ Việt Nam quyển 1, Nhà xuất bản Trẻ, tr.312- 555-538.
32. Roehrs T, Merlotti L, Zorick F, Roth T (1992), “ Rebound insomnia in normails and patients with insomnia after abrupt and tapered discon- tinuation”, Psychopharmacology; VoL108.pp.67-71.
33. Soulimani R, Younnos C, jarmouni S, Bousta D, Misslin R and Mortier F(1997), “ Behavioural effects of Passiflora incarnate and ít indole alkaloid and flavonoid derivatives and maltol in the mouse”,J.Ehnopharmacol; 57:11-20.
34. Stephen L Hauser, Dan LLông, Dennis LKasper,J.Larry jameson, Anthony S.Fauci, Joseph Loscalzo(2012), Harrison’s Principles of Internal Medicine Eighteenth Edition, Harison’s Online> Chapter 27. Sleep Disorders.
35. Silber M, Clinical practice (2005), “ Chronic insomnia”, N Engl J Med; VoL353,pp.803-810.
36. Soulimani R, Younos C, Jarmouni S, et aL Behavioural effects of Passiflora incarnate L and its indole alkaloid and flavonoid derivatives and maltol in the mouse.J EthnopharmacoLJun 1997;57(1):11-20.
37. Speroni E, Billi R, Mercati, et aL Sedative effects ò crude extract ò Passiflora incarnate after oral administration.Phytotherapy Res 1996;10:S92-S94.
38. Taylor D, Mallory LJ, Lichstein KL, et al (2007), “ Comorbidity of chronic insomnia with medical problem” sleep, VoL30,pp.213-8.
39. Trần Thị Thu Hằng (2005) Dƣợc lực học, Nhà xuất bản Phƣơng Đông, tr.163- 165.1
40. Trần Hùng (2002), Giáo trình nhận thức dược liệu, Tr.59,132,140,152.
41. Viện Dƣợc liệu (2004) ,Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 210- 215(I),138-140(II),721-726(II),1070- 1073(II).
42. http://www.tienphong.vn/suc-Khoe/552000/Benh-roi-loan-giac-ngu-cang-pho- bien-tpp.html[17/09/2011].
HÌNH ẢNH THỬ NGHIỆM