4. MỘT SỐ MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG AN THẦN GIẢI LO ÂU
2.1.3Phƣơng pháp nghiên cứu
Khảo sát một số tiêu chuẩn hóa lý của dƣợc liệu Lạc tiên tây Độ ẩm
Cân chính xác khoảng 1g dƣợc liệu vào một chén cân (đã sấy ở 105 0C đến khối lƣợng không đổi và đã cân bì), đem sấy ở 105 0C trong tủ sấy dƣới áp suất thƣờng đến khối lƣợng không đổi (chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0,5mg)
Công thức tính độ ẩm: % 100 a b a H Trong đó:
a: khối lƣợng bột dƣợc liệu trƣớc khi sấy (g) b: khối lƣợng bột dƣợc liệu sau khi sấy (g) H%: độ ẩm (kl/kl)
Tro toàn phần
Nung một chén nung bằng sứ cho tới khối lƣợng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lƣợng của chén không.
Cân chính xác khoảng 2 g dƣợc liệu cho vào chén nung. Trải đều dƣợc liệu ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi dƣợc liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói.
Dùng kẹp sắt dài đƣa chén vào lò nung ở 500-600 0C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lƣợng cân.
Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân.
Tiếp tục làm nhƣ vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lƣợng chén có tro (a) chênh lệch không quá 0,5 mg.
% 100 h c c b a A Trong đó:
A%: tro toàn phần (%) của dƣợc liệu a: khối lƣợng chén có tro
b: khối lƣợng chén không c: khối lƣợng dƣợc liệu dùng h: độ ẩm (%) của dƣợc liệu
Tro không tan trong HCl
Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên, thêm vào đó 15 ml nƣớc cất và 10 ml HCl 2N. Đậy chén bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận 10 phút rồi để nguội. Rửa mặt kính đồng hồ với 5ml nƣớc cất nóng rồi cho vào chén nung.
Tập trung chất không tan vào một phễu lọc thủy tinh xốp đã cân bì hoặc vào một giấy lọc không tro. Rửa (cả lọc và tro) bằng nƣớc cất nóng tới khi dịch lọc cho phản trung tính (thử bằng giấy quỳ).
Cho cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô, đốt, rồi nung ở 500-600 0
C trong 2 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm và cân. Nung tiếp tới khi giữa hai lần cân liên tiếp, khối lƣợng chênh lệch nhau không vƣợt quá 1,0 mg.
Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với lƣợng dƣợc liệu đã sử dụng.
Lấy khoảng 20 g bộtdƣợc liệu cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml ethanol 90%, lắc đều và đun hồi lƣu cách thủy khoảng 30 phút. Lọc, lấy dịch lọc chia đều thành 2 phần, và cô cách thủy tới cắn khô.
Đinh tính flavonoid
Thêm vào phần cắn thứ nhất 10 ml n-hexan dùng đũa thủy tinh khuấy kĩ rồi gạn bỏ lớp dung môi. Làm nhƣ vậy thêm một lần nữa. hòa tan cắn còn lại trong 4 ml ethanol 90 %, đun nóng nhẹ cho tan. Lọc, lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm ít bột magiesi rồi thêm từ từ 0,5 ml acid hydrochloric, lắc nhẹ. Dung dịch sẽ có màu đỏ cam.
Định tính alkaloid
Thêm vào phần cắn thứ hai 4 giọt amoni hydroxyd đậm đặc và 5 ml chloroform, khuấy kĩ, lọc vào bình gạn 50 mL thêm vào bình gạn 10 ml dung dịch acid sulfuric 1%. Lắc kĩ và gạn lớp acid vào 3 ốngnghiệm:
- Ống nghiệm 1: thêm 1 giọt thuốc thử Mayer sẽ cho tủa màu trắng đục - Ống nghiệm 2: thêm 1 giọt thuốc thử Bouchardat sẽ cho tủa đỏ nâu
- Ống nghiệm 3: thêm 1 giọt thuốc thử Dragendorff sẽ cho tủa màu vàng cam
Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
Điều kiện sắc ký:
- Bản mỏng Silicagel 60 F254 (Merck) - Hệ dung môi khai triển:
+ - - (100:17:13)
- 3 5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1050C trong 5 phút, quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 366 nm. Thể tích chấm: 20 µl dung dịch thử
Tiến hành:
Dùng dịch chuẩn: Cân 2 mg chuẩn vitexin hòa trong 1 ml methanol
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 10g dƣợc liệu chiết hồi lƣu với 150ml
MeOH trong 60 phút. Dịch MeOH đƣợc cô giảm áp cho đến cắn, hoà cắn vớin
.
Định lƣợng flavonoid toàn phần
Định lượng flavonoid toàn phần theo phương pháp cân
Cân chính xác khoảng 5 g dƣợc liệu cho vào bình soxhlet, chiết với 300ml MeOH cho đến khi dịch chiết không còn màu. Dịch MeOH đƣợc cô giảm áp cho đến cắn, hoà cắn với 50ml nƣớc cất. Dịch nƣớc đƣợc lắc với ether (15 lần, mỗi lần 20ml) cho đến khi lớp ether không màu hoặc màu rất nhạt. Gạn bỏ lớp ether, lớp nƣớc đƣợc lắc với EtOAc (8 lần, mỗi lần 20ml). Tập trung dịch chiết EtOAc, cô giảm áp cho đến cắn, làm khô trong tủ sấy chân không đến khối lƣợng không đổi, ta thu đƣợc flavonoid toàn phần. Cân và tính hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong dƣợc liệu. Tiến hành định lƣợng 3 lần, lấy giá trị trung bình.
Hàm lƣợng saponin toàn phần đƣợc tính theo công thức:
Trong đó ) ( 100 % A d d a A
A%: Hàm lƣợng flavonoid toàn phần trên dƣợc liệu khô kiệt
A : Độ ẩm của dƣợc liệu
a : Khối lƣợng flavonoid toàn phần d : Khối lƣợng dƣợc liệu ban đầu.
Định lượng flavonoid theo vitexin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến
Mẫu chuẩn: Cân chính xác 5 mg chuẩn vitexin hòa trong 10 ml methanol ta
đƣợc dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml, hút chính xác 500 l dung dịch trên định mức 10ml bằng methanol ta đƣợc dung dịch chuẩn.
Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 5g dƣợc liệu cho vào bình soxhlet, chiết với
300 ml MeOH cho đến khi dịch chiết không còn màu. Dịch MeOH đƣợc cô giảm áp cho đến cắn, hoà cắn với 50 ml nƣớc cất. Dịch nƣớc đƣợc lắc với ether (15 lần, mỗi lần 20 ml) cho đến khi lớp ete không màu hoặc màu rất nhạt. Gạn bỏ lớp ether, lớp nƣớc đƣợc lắc với EtOAc (8 lần, mỗi lần 20 ml). Tập trung dịch chiết EtOAc, cô giảm áp cho đến cắn. Hòa cắn trong 10ml methanol ta đƣơc dung dịch A, dung micropipette hút chính xác 50 l dung dịch A định mức 5 ml bằng methanoL
Mẫu trắng: methanol
Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu ở đỉnh hấp thu cực đại max = trên máy UV – Visible Spectrophotometre
Lƣợng flavonoid tính theo vitexin có trong dƣợc liệu đƣợc tính theo công thức sau: m n d C A A X c c t 4 10 trong đó:
At : Độ hấp thu mẫu thử Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn Cc : Nồng độ chất chuẩn (µg)
d : Độ tinh khiết của chất chuẩn (95%)
m : Khối lƣợng dƣợc liệu cần định lƣợng đã trừ ẩm (g) n : độ pha loãng (lần).