4. MỘT SỐ MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG AN THẦN GIẢI LO ÂU
4.4Mô hình môi trƣờng mở
Đây là mô hình khá phổ biến để đánh giá khả năng vận động cũng nhƣ tính lo âu của thú. Bộ dụng cụ gồm 1 hộp hình lập phƣơng một ngăn hở, làm bằng Plexiglas, với tƣờng trong suốt. Đáy mô hình đƣợc chia làm vùng rìa và vùng trung tâm bằng các ô vuông. Mỗi thú thử nghiệm đƣợc đặt ở 1 góc cố định của mô hình. Thử nghiệm đƣợc tiến hành trong 5 phút, khảo sát số lần thú thử nghiệm đứng lên, thời gian và số lần vào vùng trung tâm.
Cách đánh giá: Đặc tính của thú chỉ thích ở vùng rìa mà tránh vào vùng trung tâm khi ở môi trƣờng lạ (thigmotaxis) vì vùng trung tâm là khu vực đem lại cảm giác nguy hiểm nhiều hơn. Do đó, thời gian và số lần vào vùng trung tâm của thú tỉ lệ nghịch với biểu hiện lo âu của thú. Những thuốc có tác dụng giải lo âu có khả năng làm tăng thời gian và số lần vào vùng trung tâm. Số ô vuông di chuyển cho phép đánh giá tác động của thuốc lên khả năng vận động của thú.
CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Tiêu chuẩn dƣợc liệu và cao chiết
2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu
Lạc tiên tây (Pasiflora incarnata L.) toàn cây trên mặt đất đƣợc cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và sản xuất Dƣợc liệu Miền Trung cung cấp vào tháng 01/2011. Mẫu dƣợc liệu đƣợc lƣu lại tại Bộ môn Bào Chế Đông Dƣợc – Khoa Y Học Cổ Truyền – ĐH Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh.
2.1.2 Hóa chất và thiết bị
Hóa chất: Vitexin (Sigma Aldrich, CAS number 3681934, Lot#BCBD6147V P code 101029833, product ò Bulgaria)
Methanol, diethyl ether, chloroform, ethyl acetat, acid sulfuric
Thiết bị: Máy soxhlet, máy siêu âm, tủ sấy, bể cách thủy, bình sắc ký, …
Súc vật: Chuột nhắt trắng đực Swiss albino, 6-8 tuần tuổi, trọng lƣợng 22-25 g, bởi viện Pasteur TP. HCM cung cấp. Chuột đƣợc nuôi bầy trong bocal và đƣợc đảm bảo chu kỳ 12/12 giờ sáng tối (5g00 –17g00 là chu kỳ sáng). Chuột đƣợc làm quen với điều kiện phòng thử nghiệm ít nhất 24 giờ. Tất cả các thử nghiệm đƣợc tiến hành giữa trong khoảng 8 giờ-16 giờ.
2.1.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
Khảo sát một số tiêu chuẩn hóa lý của dƣợc liệu Lạc tiên tây Độ ẩm
Cân chính xác khoảng 1g dƣợc liệu vào một chén cân (đã sấy ở 105 0C đến khối lƣợng không đổi và đã cân bì), đem sấy ở 105 0C trong tủ sấy dƣới áp suất thƣờng đến khối lƣợng không đổi (chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0,5mg)
Công thức tính độ ẩm: % 100 a b a H Trong đó:
a: khối lƣợng bột dƣợc liệu trƣớc khi sấy (g) b: khối lƣợng bột dƣợc liệu sau khi sấy (g) H%: độ ẩm (kl/kl)
Tro toàn phần
Nung một chén nung bằng sứ cho tới khối lƣợng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lƣợng của chén không.
Cân chính xác khoảng 2 g dƣợc liệu cho vào chén nung. Trải đều dƣợc liệu ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi dƣợc liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói.
Dùng kẹp sắt dài đƣa chén vào lò nung ở 500-600 0C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lƣợng cân.
Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân.
Tiếp tục làm nhƣ vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lƣợng chén có tro (a) chênh lệch không quá 0,5 mg.
% 100 h c c b a A Trong đó:
A%: tro toàn phần (%) của dƣợc liệu a: khối lƣợng chén có tro
b: khối lƣợng chén không c: khối lƣợng dƣợc liệu dùng h: độ ẩm (%) của dƣợc liệu
Tro không tan trong HCl
Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên, thêm vào đó 15 ml nƣớc cất và 10 ml HCl 2N. Đậy chén bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận 10 phút rồi để nguội. Rửa mặt kính đồng hồ với 5ml nƣớc cất nóng rồi cho vào chén nung.
Tập trung chất không tan vào một phễu lọc thủy tinh xốp đã cân bì hoặc vào một giấy lọc không tro. Rửa (cả lọc và tro) bằng nƣớc cất nóng tới khi dịch lọc cho phản trung tính (thử bằng giấy quỳ).
Cho cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô, đốt, rồi nung ở 500-600 0
C trong 2 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm và cân. Nung tiếp tới khi giữa hai lần cân liên tiếp, khối lƣợng chênh lệch nhau không vƣợt quá 1,0 mg.
Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với lƣợng dƣợc liệu đã sử dụng.
Lấy khoảng 20 g bộtdƣợc liệu cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml ethanol 90%, lắc đều và đun hồi lƣu cách thủy khoảng 30 phút. Lọc, lấy dịch lọc chia đều thành 2 phần, và cô cách thủy tới cắn khô. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đinh tính flavonoid
Thêm vào phần cắn thứ nhất 10 ml n-hexan dùng đũa thủy tinh khuấy kĩ rồi gạn bỏ lớp dung môi. Làm nhƣ vậy thêm một lần nữa. hòa tan cắn còn lại trong 4 ml ethanol 90 %, đun nóng nhẹ cho tan. Lọc, lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm ít bột magiesi rồi thêm từ từ 0,5 ml acid hydrochloric, lắc nhẹ. Dung dịch sẽ có màu đỏ cam.
Định tính alkaloid
Thêm vào phần cắn thứ hai 4 giọt amoni hydroxyd đậm đặc và 5 ml chloroform, khuấy kĩ, lọc vào bình gạn 50 mL thêm vào bình gạn 10 ml dung dịch acid sulfuric 1%. Lắc kĩ và gạn lớp acid vào 3 ốngnghiệm:
- Ống nghiệm 1: thêm 1 giọt thuốc thử Mayer sẽ cho tủa màu trắng đục - Ống nghiệm 2: thêm 1 giọt thuốc thử Bouchardat sẽ cho tủa đỏ nâu
- Ống nghiệm 3: thêm 1 giọt thuốc thử Dragendorff sẽ cho tủa màu vàng cam
Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
Điều kiện sắc ký:
- Bản mỏng Silicagel 60 F254 (Merck) - Hệ dung môi khai triển:
+ - - (100:17:13)
- 3 5
1050C trong 5 phút, quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 366 nm. Thể tích chấm: 20 µl dung dịch thử
Tiến hành:
Dùng dịch chuẩn: Cân 2 mg chuẩn vitexin hòa trong 1 ml methanol
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 10g dƣợc liệu chiết hồi lƣu với 150ml
MeOH trong 60 phút. Dịch MeOH đƣợc cô giảm áp cho đến cắn, hoà cắn vớin
.
Định lƣợng flavonoid toàn phần
Định lượng flavonoid toàn phần theo phương pháp cân
Cân chính xác khoảng 5 g dƣợc liệu cho vào bình soxhlet, chiết với 300ml MeOH cho đến khi dịch chiết không còn màu. Dịch MeOH đƣợc cô giảm áp cho đến cắn, hoà cắn với 50ml nƣớc cất. Dịch nƣớc đƣợc lắc với ether (15 lần, mỗi lần 20ml) cho đến khi lớp ether không màu hoặc màu rất nhạt. Gạn bỏ lớp ether, lớp nƣớc đƣợc lắc với EtOAc (8 lần, mỗi lần 20ml). Tập trung dịch chiết EtOAc, cô giảm áp cho đến cắn, làm khô trong tủ sấy chân không đến khối lƣợng không đổi, ta thu đƣợc flavonoid toàn phần. Cân và tính hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong dƣợc liệu. Tiến hành định lƣợng 3 lần, lấy giá trị trung bình.
Hàm lƣợng saponin toàn phần đƣợc tính theo công thức:
Trong đó ) ( 100 % A d d a A
A%: Hàm lƣợng flavonoid toàn phần trên dƣợc liệu khô kiệt
A : Độ ẩm của dƣợc liệu
a : Khối lƣợng flavonoid toàn phần d : Khối lƣợng dƣợc liệu ban đầu.
Định lượng flavonoid theo vitexin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến
Mẫu chuẩn: Cân chính xác 5 mg chuẩn vitexin hòa trong 10 ml methanol ta
đƣợc dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml, hút chính xác 500 l dung dịch trên định mức 10ml bằng methanol ta đƣợc dung dịch chuẩn.
Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 5g dƣợc liệu cho vào bình soxhlet, chiết với
300 ml MeOH cho đến khi dịch chiết không còn màu. Dịch MeOH đƣợc cô giảm áp cho đến cắn, hoà cắn với 50 ml nƣớc cất. Dịch nƣớc đƣợc lắc với ether (15 lần, mỗi lần 20 ml) cho đến khi lớp ete không màu hoặc màu rất nhạt. Gạn bỏ lớp ether, lớp nƣớc đƣợc lắc với EtOAc (8 lần, mỗi lần 20 ml). Tập trung dịch chiết EtOAc, cô giảm áp cho đến cắn. Hòa cắn trong 10ml methanol ta đƣơc dung dịch A, dung micropipette hút chính xác 50 l dung dịch A định mức 5 ml bằng methanoL (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu trắng: methanol
Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu ở đỉnh hấp thu cực đại max = trên máy UV – Visible Spectrophotometre
Lƣợng flavonoid tính theo vitexin có trong dƣợc liệu đƣợc tính theo công thức sau: m n d C A A X c c t 4 10 trong đó:
At : Độ hấp thu mẫu thử Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn Cc : Nồng độ chất chuẩn (µg)
d : Độ tinh khiết của chất chuẩn (95%)
m : Khối lƣợng dƣợc liệu cần định lƣợng đã trừ ẩm (g) n : độ pha loãng (lần).
2.2 Chiết xuất cao và khảo sát tiêu chuẩn cao Lạc tiên tây 2.2.1 Chiết xuất cao 2.2.1 Chiết xuất cao
Dung môi: Ethanol dƣợc dụng 60 %. Tỷ lệ dƣợc liệu : dung môi là 1:10 Phƣơng pháp chiết xuất: ngâm kiệt ở nhiệt độ thƣờng
Bốc hơi dung môi dƣới áp suất giảm đến cao đặc.
2.2.2 Khảo sát một số tiêu chuẩn cao Độ ẩm Độ ẩm
Cân chính xác khoảng 0,5 g cao vào một chén cân (đã sấy ở 105 0C đến khối lƣợng không đổi và đã cân bì), đem sấy ở 105 0C trong tủ sấy dƣới áp suất thƣờng đến khối lƣợng không đổi(nghĩa là chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0,5 mg)
Tính độ ẩm theo công thức: % 100 a b a H Trong đó:
a: khối lƣợng bột cao trƣớc khi sấy (g) b: khối lƣợng bột cao sau khi sấy (g) H%: độ ẩm (kl/kl)
Tro phần
Nung một chén nung bằng sứ cho tới khối lƣợng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lƣợng của chén không (b).
Cân chính xác khoảng 2 g cao cho vào chén nung. Trải đều cao ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi cao cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói.
Dùng kẹp sắt dài đƣa chén vào lò nung ở 500-600 0C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lƣợng cân.
Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân.
Tiếp tục làm nhƣ vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lƣợng chén có tro (a) chênh lệch không quá 0,5 mg.
Tro toàn phần tính trên cao khô kiệt theo công thức: 100 %
h c c b a A Trong đó:
A%: tro toàn phần (%) của cao a: khối lƣợng chén có tro b: khối lƣợng chén không c: khối lƣợng cao dùng h: độ ẩm (%) của cao
Lấy khoảng 2 g cao, thêm 50 ml ethanol 90 %, lắc đều và đun hồi lƣu cách thủy khoảng 30 phút. Lọc, lấy dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm khác nhau để làm phản ứng hóa học.
Ống 1: Lấy 3 ml dịch lọc, thêm vào 3 giọt NaOH 10% dung dịch có màu đỏ cam.
Ống 2: Lấy 3 ml dịch lọc, thêm vào 3 giọt FeCl3 dung dung dịch có màu xanh rêu.
Ống 3: Lấy 3 ml dịch lọc, thêm vào 3 giọt TT chì acetat dung dịch có tủa trắng đục.
:
Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Lạc tiên tây trong cao Điều kiện sắc ký:
- Bản mỏng Silicagel 60 F254 (Merck)
- Hệ dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat (5:5) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- - – (7:1:2)
Thuốc thử hiện màu:
Quan sát dƣới ánh sáng thƣờng
Quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 254nm. Quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 366nm.
3 5 105 0C trong 5
phút, quan sát dƣới ánh sáng thƣờng và dƣới đèn tử ngoại ở = 366nm.
2SO4 10 % trong ethanol, quan sát dƣới ánh sáng thƣờng
Thể tích chấm: 20 µl dung dịch thử Tiến hành:
Dung dịch nguyên liệu: Cân 10 g nguyên liệu Lạc tiên tây, chiết hồi lƣu với 100ml
cồn 60 0
C lọc. Dịch lọc đƣợc cô đến cắn, hoà với 2 .
Dung dịch cao: Cân chính xác khoảng 0,5 g cao hoà tan trong 20 ml cồn 60 0
C, lọc. Dịch lọc đƣợc cô đến cắn, hoà với 2 ..
Kiểm tra sự hiện diện của vitexin trong cao Điều kiện sắc ký:
- Bản mỏng Silicagel 60 F254 (Merck)
- Hệ dung môi khai triển:
- - (100:17:13)
Ethyl acetat - acid formic - acid acetic – nƣớc (100:11:11:26) Thuốc thử hiện màu:
3 5 105 0C trong 5
phút, quan sát dƣới ánh sáng thƣờng và dƣới đèn tử ngoại ở = 366nm.
Thể tích chấm: 20 µl dung dịch thử Tiến hành:
Dung dịch chuẩn: Cân 2 mg chuẩn vitexin hòa trong 1 ml methanol
ether cho đến khi
.
Định lƣợng flavonoid toàn phần và vitexin trong cao
Định lƣợng flavonoid toàn phần theo phƣơng pháp cân
Cân chính xác 1g cao cho vào bình soxhlet, chiết với 300ml MeOH cho đến khi dịch chiết không còn màu. Dịch MeOH đƣợc cô giảm áp cho đến cắn, hoà cắn với 50ml nƣớc cất. Dịch nƣớc đƣợc lắc với ether (8 lần, mỗi lần 20ml) cho đến khi lớp ete không màu hoặc màu rất nhạt. Gạn bỏ lớp ether, lớp nƣớc đƣợc lắc với EtOAc (12 lần, mỗi lần 20ml). Tập trung dịch chiết EtOAc, cô giảm áp cho đến cắn, làm khô trong tủ sấy chân không đến khối lƣợng không đổi, ta thu đƣợc flavonoid toàn phần. Cân và tính hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong cao. Tiến hành định lƣợng 3 lần, lấy giá trị trung bình.
Hàm lƣợng saponin toàn phần đƣợc tính theo công thức:
Với A%: Hàm lƣợng flavonoid toàn phần trên cao khô kiệt
A : Độ ẩm của cao (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a : Khối lƣợng flavonoid toàn phần d : Khối lƣợng cao ban đầu.
Định lƣợng flavonoid theo bằng phƣơng pháp quang phổ tử ngoại khả kiến
Mẫu chuẩn: Cân chính xác 5 mg chuẩn vitexin hòa trong 10 ml methanol ta
đƣợc dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml, hút chính xác 500 l dung dịch trên định mức 10 ml bằng methanol ta đƣợc dung dịch chuẩn.
) ( 100 % A d d a A
Mẫu thử: Cân chính xác 1g cao cho vào bình soxhlet, chiết với 300 ml MeOH
cho đến khi dịch chiết không còn màu. Dịch MeOH đƣợc cô giảm áp cho đến cắn, hoà cắn với 50ml nƣớc cất. Dịch nƣớc đƣợc lắc với ether (15 lần, mỗi lần 20ml) cho đến khi lớp ete không màu hoặc màu rất nhạt. Gạn bỏ lớp ether, lớp nƣớc đƣợc lắc với EtOAc (8 lần, mỗi lần 20ml). Tập trung dịch chiết EtOAc, cô đến cắn hòa tan trong MeOH 10ml methanol ta đƣơc dung dịch A, dùng micropipette hút chính xác 20 l dung dịch A định mức 10µl bằng methanol.
Mẫu trắng: methanol
Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu ở đỉnh hấp thu cực đại max = trên máy UV – Visible Spectrophotometre
Lƣợng flavonoid tính theo vitexin có trong cao đƣợc tính theo công thức:
m n d C A A X c c t 4 10 Trong đó: At : Độ hấp thu mẫu thử Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn Cc : Nồng độ chất chuẩn (µg/ml)
d : Độ tinh khiết của chất chuẩn (95%)
m : Khối lƣợng cao cần định lƣợng đã trừ ẩm (g) n : độ pha loãng
2.3 Thử độc tính cấp 2.3.2 Súc vật thử nghiệm 2.3.2 Súc vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng, giống đực, chủng Swiss albino, 5- 6 tuần tuổi, khối lƣợng từ 18 – 22 g, đƣợc cung cấp bởi Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh.
Chuột đƣợc nuôi ổn định trong lồng nhựa (28 cm × 17cm ×14cm) bằng thức ăn cám viên với thành phần bột gạo, bột bắp và vitamin bổ sung một tuần trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Số lƣợng: mỗi lồng 6- 8 con. Chuột đƣợc nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng với chu kỳ 12 giờ sáng và 12 giờ tối.
2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Nguyên tắc Nguyên tắc
Chuột nhắt trắng đƣợc chia làm các nhóm tƣơng tự. Những chuột ở cùng nhóm sẽ nhận cùng một liều chất khảo sát nhƣng các liều này sẽ thay đổi theo từng nhóm chuột. Sự đánh giá kết quả dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết) nhận thấy ở mỗi chuột trong nhóm. Nên chọn liều ở cấp số nhân để đƣợc lgarit của liều ở cấp số cộng.
Quan sát và ghi kết quả
Ghi các biểu hiện độc và mức độ nghiêm trọng: sự xuất hiện độc tính, tiến