4. MỘT SỐ MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG AN THẦN GIẢI LO ÂU
2.8Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu
Số liệu thực nghiệm đƣợc biểu diễn dƣới dạng trung bình ± sai số chuẩn (M ± SD). Dùng phép kiểm T-test và anova một yếu tố với phần mềm Minitab 15.0 để so sánh ý nghĩa thống kê. Vẽ đồ thị bằng chƣơng trình Microsoft Excel 2007.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tiêu chuẩn dƣợc liệu
* Cảm quan
Đoạn thân dài 3 – 5 cm, mang tua cuốn và lá, có lẫn hoa. Thân và lá có nhiều lông, phiến lá mỏng, màu hơi vàng nâu, dễ vụn nát, mép lá có răng cƣa, gốc lá hình tim, tua cuống ở nách lá.
* Độ ẩm
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ ẩm dược liệu Lạc tiên tây
Mẫu thử Độ ẩm (%) Trung bình (%)
Lần 1 8,994
8,982 ± 0,015
Lần 2 8,988
Lần 3 8,965
Nhận xét: Độ ẩm của dƣợc liệu Lạc tiên tây là 8,982 % .
* Độ tro
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát tro toàn phần dược liệu Lạc tiên tây
Mẫu thử Tro toàn phần (%) Trung bình (%)
Mẫu 1 0,148
0,149 ± 0,003
Mẫu 2 0,148
Mẫu 3 0,152
Nhận xét: Tro toàn phần của dƣợc liệu Lạc tiên tây là 0,149 % ( < 2 % ).
Mẫu thử Tro không tan trong HCl (%) Trung bình (%)
Mẫu 1 0,006
0,006
Mẫu 2 0,006
Mẫu 3 0,006
Nhận xét: Tro không tan trong acid của dƣợc liệu Lạc tiên tây là 0,006 % .
* Soi bột dƣợc liệu
Trong bột nguyên liệu Lạc tiên tây có sự hiện diện của lông che chở đơn bào có gai, lông tiết, mảng biểu bì có chứa lỗ khí, mảnh nhựa, có chứa tinh thể canxi oxalate hình cầu gai, có mạch mạng, mảch vạch và mạch ngăn chấm đồng tiền. Phù hợp với những đặc điểm vi học điển hình của Lạc tiên tây đã đƣợc mô tả trong Dƣợc điển Châu Âu.
g. Mạch mạng h. Lông tiết
Hình3.1: Đặc điểm soi bột Lạc tiên tây
* Vi phẫu Vi phẫu lá (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Gân giữa: Gân trên lồi hơn nhiều so với gân dƣới. Cấu tạo gân lá khá đơn giản. Bên ngoài là lớp biểu bì tẩm cutin, kế đến là 3- 4 lớp tế bào mô dày góc, đặc biệt ở gân trên của lá mô dày gần nhƣ chiếm toàn bộ phần diện tích gần trên. Kế đến lớp mô dày và kéo dài vào đến hết vùng tủy là mô mềm đạo. Vùng tủy có từ 3- 4 bó
a. Mạch chấm đồng tiền b. Lỗ khí c. Mảnh biểu bì
d. Lông che chở e. Mảnh nhựa, canxi oxalate f. Mạch vạch
libe – gỗ xếp thành hình vòng cung gaần tròn với libe bên ngoài, gỗ bên trong. Các tế bào mô mềm ở gần lớp mô dày và các tế bào nằm trong vùng libe thƣờng chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai
- Phiến lá: Cấu tạo khá đơn giản theo kiểu dị thể bất đối. Hai mặt của phiến lán có biểu bì trên và dƣới. Dƣới biểu bì trên là lớp mô mềm dậu chứa rất nhiều diệp lục. Dƣới lớp mô mềm giậu này là lớp mô mềm khuyết.
Hình 3.2 Đặc điểm vi phẫu lá Lạc tiên tây
Vi phẫu thân
Cấu tạo thân: Thân có tiết diện hơi tròn, phần vỏ chiếm khoảng 1/4, phần trung trụ chiếm ¾. Bên ngoài cùng là lớp tế bào biểu bì tẩm cutin. Bên trong lớp biểu bì có khoảng 2-3 lớp mô dày góc, kế đến là lớp mô mềm vỏ dạng mô mềm đạo. Nội bì không thấy rõ, trụ bì hóa mô cứng thành từng cụm đi suốt tiết diện thân. Vùng trung trụ gồm libe 2 và gỗ 2 với các tế bào xếp đồng tâm và xuyên tâm, các mạch gỗ 2, to, rõ, nhỏ dần về phía tủy. Libe 1 bị ép dẹp và dồn về phía vỏ không còn
Biểu bì Mô dày góc
Mô mềm dậu và mô khuyết
Bó libe – gỗ Mô mềm đạo Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
nhìn thấy rõ. Dƣới chân các bó gỗ 1 xuất hiện thêm các tế bào libe, đây là các libe trong (còn gọi là libe quanh tủy). Trong thân bắt gặp nhiều tinh thể calci oxat hình cầu gai, tập trung nhiều ở vùng libe và mô mềm vỏ. Vùng tủy của thân rỗng.
Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu thân Lạc tiên tây
* Định tính
Phương pháp hóa học
Hợp chất flavonoid: Dịch chiết dƣợc liệu cho màu đỏ cam với bột Mg và HCl.
- Thuốc thử Mayer - Thuốc thử Bouchardat - Thuốc thử Dragendorff Phương pháp sắc ký lớp mỏng Biểu bì tẩm cutin Mô dày góc Mô mềm đạo Sợi trụ bì Gỗ Libe
Hệ dung môi khai triển
Ethyl acetat – methanol nƣớc
(100:17:13)
Ethyl acetat – acid formic – acid acetic- nƣớc
(100:11:11:26)
1. Chất chuẩn vitexin 2. Nguyên liệu Lạc tiên tây
3 1100C trong 10 phút
và quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 366nm.
Hình 3.4: Kết quả định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của vết thu đƣợc trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ Lạc tiên tây tƣơng ứng với màu sắc và giá trị Rf vết thu đƣợc của chuẩn vitexin. Nhƣ vậy, trong Lạc tiên tây có sự hiện diện của hợp chất vitexin.
* Định lƣợng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp cân
1 2
Bảng 3.4 Kết quả định lượng flavonoid toàn phần tính theo phương pháp cân
Mẫu Flavonoid toàn phần (%) Trung bình (%)
Mẫu 1 0,971
0,986 ± 0,04
Mẫu 2 0,998
Mẫu 3 0,988
Nhận xét: Hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong Lạc tiên tây là 0,986% ± 0,04(%).
Định lượng vitexin bằng phương pháp quang phổ
Hình 3.6: Đỉnh hấp thu cực đại của vitexin trong mẫu nguyên liệu Lạc tiên tây
Nhận xét: Đỉnh hấp thu cực đại của vitexin mẫu thử nguyên liệu Lạc tiên tây là 272 nm, gần tƣơng ứng với đỉnh hấp thu cực đại của vitexin trong methanol (271 nm).
Bảng 3.5: Kết quả định lượng flavonoid tính theo vitexin
Mẫu Hàm lƣợng vitexin (%) Trung bình (%)
Mẫu 1 0,614
0,617 ± 0,04
Mẫu 2 0,622
Mẫu 3 0,615
Nhận xét: Hàm lƣợng flavonoid tính theo vitexin trong Lạc tiên tây là 0,617 % ± 0,04 (%).
Bảng 3.6: Tóm tắt kết quả các chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu Lạc tiên tây so với tiêu chuẩn cơ sở
STT Tiêu chí Kết quả
1 Độ ẩm 8,982 %
2 Độ tro 0,149 %
3 Độ tro không tan trong HCl 0,006 %
4 Định tính:
1. Phản ứng hóa học 2. Sắc ký lớp mỏng
Đúng
5 Định lƣợng
Flavonoid toàn phần theo phƣơng pháp cân
Flavonoid tính theo vitexin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0,986 %
0,617 %
3.2. Chiết xuất và khảo sát tiêu chuẩn cao Lạc tiên tây 3.2.1 Chiết xuất cao Lạc tiên tây 3.2.1 Chiết xuất cao Lạc tiên tây
Ngâm 500 g dƣợc liệu Lạc tiên tây trong 5000 ml cồn 60% ở nhiệt độ thƣờng. Sau 14 ngày, rút lấy dịch chiết. Bốc hơi dung môi, thu đƣợc 86 g cao .
Hiệu suất chiết cao Lạc tiên tây là:
3.2.2. Khảo sát chỉ tiêu chất lƣợng của cao Lạc tiên tây * Độ ẩm * Độ ẩm
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ ẩm cao Lạc tiên tây
Mẫu Độ ẩm (%) Trung bình (%) Mẫu 1 17,67 17,67 ± 0,01 Mẫu 2 17,65 Mẫu 3 17,8 Nhận xét: Độ ẩm cao dƣợc liệu đạt 17,67 % ± 0,01
Nhận xét : Độ ẩm cao cồn dƣợc liệu Lạc Tiên Tây đạt tiêu chuẩn về độ ẩm theo Dƣợc Điển Việt Nam IV đối với cao đặc.
* Độ tro
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tro toàn phần cao Lạc tiên tây
Mẫu Tro toàn phần (%) Trung bình(%)
Mẫu 1 0,214
0,216 ± 0,003
Mẫu 2 0,224
Mẫu 3 0,211
Nhận xét: Độ tro toàn phần của cao Lạc Tiên tây 0,216 % ± 0,003.
* Định tính
Phương pháp hóa học
Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Hệ dung môi khai triển
Toluen – Ethyl acetat (5: 5)
1. Nguyên liệu 2. Cao Lạc tiên tây Quan sát dƣới ánh sáng thƣờng Quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 254nm. Quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 366nm H2SO4 1100C trong 10 phút và quan sát dƣới ánh sáng thƣờng.
Hình 3.7: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao Lạc tiên tây với hệ dung môi Toluen – Ethyl acetat
Hệ dung môi khai triển
- - – (7:1:2)
1. Nguyên liệu Lạc tiên tây 2. Cao Lạc tiên tây Quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 254nm. Quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 366nm. 3 sấy ở 1100 C trong 10 phút và quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 366nm.
Hình 3.8: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao Lạc tiên tây với hệ dung môi n- butanol – acid acetic – nước
Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của các vết trên sắc đồ cao Lạc tiên tây tƣơng ứng với màu sắc và giá trị Rf của các vết trong nguyên liệu Lạc tiên tây. Cho thấy, thành phần hóa thực vật trong cao tƣơng đồng với nguyên liệu.
- – c (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(100:17:13)
Ethyl acetat - acid formic - acid acetic – nƣớc (100:11:11:26)
1.Chuẩn vitexin 2. Cao Lạc tiên tây
3 110 0 C trong 10
phút và quan sát dƣới đèn tử ngoại ở = 366nm
Hình 3.9: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao Lạc tiên tây với hệ dung môi
Ethyl acetat- methanol – nước và Ethyl acetat acid formic – acid acetic – nước
Nhận xét: Màu sắc và giá trị Rf của các vết trên sắc đồ cao Lạc tiên tây tƣơng ứng với màu sắc và giá trị Rf của chuẩn vitexin. Chứng tỏ trong cao Lạc tiên tây có sự hiện diện của vitexin.
* Định lƣợng
Định lượng flavonoid toàn phần theo phương pháp cân
Bảng 3.9 Kết quả định lƣợng flavonoid toàn phần theo phƣơng pháp cân Mẫu thử Flavonoid toàn phần (%)
Mẫu 1 2,875
2,882 ± 0,01
Mẫu 2 2,892
Mẫu3 2,87
Nhận xét: Flavonoid toàn phần trong cao Lạc tiên tây là 2,882%.
Định lượng flavonoid tính theo vitexin bằng phương pháp quang phổ
Hình 3.11 Đỉnh hấp thu cực đại của vitexin trong mẫu thử cao Lạc tiên tây
Nhận xét: Đỉnh hấp thu cực đại của vitexin mẫu thử cao Lạc tiên tây là 271 nm, tƣơng ứng với đỉnh hấp thu cực đại của vitexin trong methanol.
Bảng 3.10 Kết quả định lượng hàm lượng flavonoid tính theo vitexin
Mẫu thử Flavonoid theo vitexin (%) Trung bình (%) Mẫu 1 2,132 2,087 ± 0,039 Mẫu 2 2,057 Mẫu 3 2,073
Kết luận : Hàm lƣợng flavonoid tính theo vitexin trong cao Lạc tiên tây là 2,087 % ± 0,039
3.3. Kết quả thử nghiệm độc tính và tác dụng an thần của cao Lạc tiên tây 3.3.1. Độc tính cấp 3.3.1. Độc tính cấp
Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cao Lạc tiên tây
Lô thử Liều dùng (g/kg chuột cao 6:1) Số chuột thử thăm dò Số chuột chết trong lô Phân suất tử vong 1 0,8 06 0 0% 2 1,6 06 0 0% 3 3,2 06 0 0% Nhận xét:
Với liều tối đa có thể phân tán cao trong nƣớc và bơm trực tiếp vào dạ dày chuột qua qua kim đầu tù là 3,2 g cao/kg thể trọng chuột nhắt, tƣơng đƣơng liều dùng trên ngƣời là 14,88 g cao/kg (khoảng44,4 g dƣợc liệu), không có chuột chết. trong vòng 72 giờ sau uống thuốc. Do đó, chƣa xác định đƣợc LD50đƣờng uống của cao Lạc tiên tây trên chuột nhắt trắng.
Trong suốt thời gian 2 tuần sau uống thuốc, không ghi nhận đƣợc bất kỳ dấu hiệu bất thƣờng nào trên chuột thử nghiệm. Tất cả chuột đều ăn uống và sinh hoạt bình thƣờng, không có chuột chết.
Kết quả giải phẫu chuột ở cả 3 lô để quan sát đại thể các phủ tạng, cho thấy: tất cả các chuột thử nghiệm không thấy bất kỳ dấu hiệu bất thƣờng nào về hình thái của tim, gan, thận, bàng quang và hệ tiêu hóa so với nhóm chứng uống nƣớc cất.
Từ liều tối đa Dmax = 3,2 g/kg thể trọng chuột, chúng tôi chọn liều cao Lạc tiên tây cho các thử nghiệm dƣợc lý tiếp theo là 150 mg/kg (gần tƣơng đƣơng 1/20 Dmax) ( LTT150) và 300 mg/kg (gần tƣơng đƣơng 1/10 Dmax)(LTT300). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2. Kết quả thử nghiệm tác dụng hợp đồng của cao Lạc tiên tây với Thiopental Thiopental
Bảng 3.12: Kết quả khảo sát dƣợc lý tác dụng hiệp đồng với Thiopental Lô thử nghiệm Thời gian ngủ mê
(phút) % so với lô chứng P C Thiopental 40mg/kg 4,4 ± 5,3 100% >0,05 LTT 150 Thiopental 40mg/kg + LTT 150mg/kg 5,46 ± 2,5 124,09 % >0,05 LTT300 Thiopental 40mg/kg + LTT 300mg/kg 8,13 ± 9,7* 184,72% <0,05
Hình 3.12: Thời gian ngủ mê của chuột (phút) sau tiêm thiopental và uống thuốc thử
Nhận xét:
Lô thử nghiệm LTT 150 tại thời điểm 60 phút sau khi uống thuốc, thời gian ngủ mê của chuột khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P > 0,05)
Lô thử nghiệm LTT300 tại thời điểm 60 phút sau khi uống thuốc, thời gian ngủ mê của chuột khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P< 0,05).
Kết quả thử nghiệm cho thấy cao Lạc tiên tây liều 300mg/kg chuột tại thời điểm 60 phút sau khi uống thuốc làm tăng thời gian ngủ có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
3.3.3. Kết quả thử nghiệm tác dụng an thần giải lo âu với mô hình chữ thập nâng cao nâng cao
Bảng 3.13: Kết quả thử nghiệm trên mô hình chữ thập nâng cao
Lô
Sau 30 phút uống thuốc Sau 60 phút uống thuốc Số lần ra Thời gian lƣu lại Số lẩn ra Thời gian lƣu lại
nhánh mở nhánh mở (phút) nhánh mở nhánh mở (phút) Chứng 0,38 ± 0,37 0,27 ± 0,06 0,37 ± 0,26 0,23 ± 0,06 DZP 2mg/kg 2 ± 0,46* 0,63 ± 0,14 1,75 ± 0,45* 0,61 ± 0,14 LTT150mg/ kg 3,38 ± 0,62** 0,32 ± 0,15 2,25 ± 0,49* 0,55 ± 0,25 LTT300mg/ kg 2,5 ± 0,57* 0,32 ± 0,05 3,88 ± 0,64** 1,67 ± 0,36 Nhận xét:
- Số lần ra nhánh mở và thời gian lƣu lại nhánh mở của chuột uống DZP 2mg/kg chuột khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,05) ở cả 2 thời điểm 30 phút và 60 phút.
- Số lần ra nhánh mở và thời gian lƣu lại nhánh mở của lô LTT150 khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở cả 2 thời điểm 30 phút (P<0,01) và 60 phút (P<0,05).
- Số lần ra nhánh mở và thời gian lƣu lại nhánh mở của lô LTT300 khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở cả 2 thời điểm 30 phút (P<0,05) và 60 phút (P<0,01).
Ghi chú: * Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,05) ** Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,01)
Hình 3.13: Biểu đồ so sánh số lần ra nhánh mở bằng MH CTNC thời điểm sau 30 phút
Kết quả thử nghiệm trên mô hình chữ thập nâng cao cho thấy: cả 2 liều LTT150 và LTT300 đều thể hiện tác dụng an thần giải lo âu trên chuột nhắt sau khi uống 30 phút và 60 phút. Trong đó, liều 150 mg/kg sau 30 phút uống thuốc và 300mg/kg sau 60 phút uống thuốc có khác biệt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01). * * ** * * **
Hình 3.14: Biểu đồ so sánh số lần ra nhánh mở bằng MH CTNC thời điểm sau 60 phút
3.3.4 Kết quả thử nghiệm mô hình hai ngăn sáng tối
Bảng 3.14 Kết quả thử nghiệm mô hình hai ngăn sáng tối
Lô thử nghiệm
Số lần và % chuột ra ngăn sáng
Tổng thời gian và % chuột lƣu lại ngăn sáng
P Lô chứng 5,77 ± 1,09 32,22% ± 1,68 1:45 ±0,02 35,11% ± 11 >0,05 Lô Diazepam 8,37 ± 3,9 * 33,38 % ± 3,5 2: 34 ± 0,02* 51,63 % ± 8,25 < 0,05 Lô LTT150 7,28 ± 3,7 33,64% ± 2,7 2:44 ± 0,03* 54,69 % ± 13,9 < 0,05 Lô LTT300 6,17 ± 1,73 32,72% ± 9,5 2:06 ±0,03 42% ± 18,6 > 0,05 Kết quả :
Kết luận : So với nhóm chứng, chỉ có Diazepam liều 2 mg/kg ( p.o) có tác dụng làm tăng thời gian ở ngăn sáng của lô chuột thử nghiệm có ý nghĩa thống kê ( p < 0,05).Tuy nhiên tổng thời gian chuột lƣu lại ngăn sáng ở lô DZP và LTT150 tăng có ý nghĩa thống kê với lô chứng.Trong khi tổng thời gian lƣu lại ngăn sáng của LTT300 tăng nhƣng không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
Kết luận : Nhƣ vậy Lạc tiên tây ở liều 150 mg/kg và 300 mg/kg cao cồn Lạc tiên tại thời điểm 60 phút sau khi uống thuốc làm tăng thời gian lƣu lại ngăn sáng của (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});