4. MỘT SỐ MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG AN THẦN GIẢI LO ÂU
3.3.Kết quả thử nghiệm độc tính và tác dụng an thần của cao Lạc tiên tây
3.3.1. Độc tính cấp
Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cao Lạc tiên tây
Lô thử Liều dùng (g/kg chuột cao 6:1) Số chuột thử thăm dò Số chuột chết trong lô Phân suất tử vong 1 0,8 06 0 0% 2 1,6 06 0 0% 3 3,2 06 0 0% Nhận xét:
Với liều tối đa có thể phân tán cao trong nƣớc và bơm trực tiếp vào dạ dày chuột qua qua kim đầu tù là 3,2 g cao/kg thể trọng chuột nhắt, tƣơng đƣơng liều dùng trên ngƣời là 14,88 g cao/kg (khoảng44,4 g dƣợc liệu), không có chuột chết. trong vòng 72 giờ sau uống thuốc. Do đó, chƣa xác định đƣợc LD50đƣờng uống của cao Lạc tiên tây trên chuột nhắt trắng.
Trong suốt thời gian 2 tuần sau uống thuốc, không ghi nhận đƣợc bất kỳ dấu hiệu bất thƣờng nào trên chuột thử nghiệm. Tất cả chuột đều ăn uống và sinh hoạt bình thƣờng, không có chuột chết.
Kết quả giải phẫu chuột ở cả 3 lô để quan sát đại thể các phủ tạng, cho thấy: tất cả các chuột thử nghiệm không thấy bất kỳ dấu hiệu bất thƣờng nào về hình thái của tim, gan, thận, bàng quang và hệ tiêu hóa so với nhóm chứng uống nƣớc cất.
Từ liều tối đa Dmax = 3,2 g/kg thể trọng chuột, chúng tôi chọn liều cao Lạc tiên tây cho các thử nghiệm dƣợc lý tiếp theo là 150 mg/kg (gần tƣơng đƣơng 1/20 Dmax) ( LTT150) và 300 mg/kg (gần tƣơng đƣơng 1/10 Dmax)(LTT300).
3.3.2. Kết quả thử nghiệm tác dụng hợp đồng của cao Lạc tiên tây với Thiopental Thiopental
Bảng 3.12: Kết quả khảo sát dƣợc lý tác dụng hiệp đồng với Thiopental Lô thử nghiệm Thời gian ngủ mê
(phút) % so với lô chứng P C Thiopental 40mg/kg 4,4 ± 5,3 100% >0,05 LTT 150 Thiopental 40mg/kg + LTT 150mg/kg 5,46 ± 2,5 124,09 % >0,05 LTT300 Thiopental 40mg/kg + LTT 300mg/kg 8,13 ± 9,7* 184,72% <0,05
Hình 3.12: Thời gian ngủ mê của chuột (phút) sau tiêm thiopental và uống thuốc thử
Nhận xét:
Lô thử nghiệm LTT 150 tại thời điểm 60 phút sau khi uống thuốc, thời gian ngủ mê của chuột khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P > 0,05)
Lô thử nghiệm LTT300 tại thời điểm 60 phút sau khi uống thuốc, thời gian ngủ mê của chuột khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P< 0,05).
Kết quả thử nghiệm cho thấy cao Lạc tiên tây liều 300mg/kg chuột tại thời điểm 60 phút sau khi uống thuốc làm tăng thời gian ngủ có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
3.3.3. Kết quả thử nghiệm tác dụng an thần giải lo âu với mô hình chữ thập nâng cao nâng cao
Bảng 3.13: Kết quả thử nghiệm trên mô hình chữ thập nâng cao
Lô
Sau 30 phút uống thuốc Sau 60 phút uống thuốc Số lần ra Thời gian lƣu lại Số lẩn ra Thời gian lƣu lại
nhánh mở nhánh mở (phút) nhánh mở nhánh mở (phút) Chứng 0,38 ± 0,37 0,27 ± 0,06 0,37 ± 0,26 0,23 ± 0,06 DZP 2mg/kg 2 ± 0,46* 0,63 ± 0,14 1,75 ± 0,45* 0,61 ± 0,14 LTT150mg/ kg 3,38 ± 0,62** 0,32 ± 0,15 2,25 ± 0,49* 0,55 ± 0,25 LTT300mg/ kg 2,5 ± 0,57* 0,32 ± 0,05 3,88 ± 0,64** 1,67 ± 0,36 Nhận xét:
- Số lần ra nhánh mở và thời gian lƣu lại nhánh mở của chuột uống DZP 2mg/kg chuột khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,05) ở cả 2 thời điểm 30 phút và 60 phút.
- Số lần ra nhánh mở và thời gian lƣu lại nhánh mở của lô LTT150 khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở cả 2 thời điểm 30 phút (P<0,01) và 60 phút (P<0,05).
- Số lần ra nhánh mở và thời gian lƣu lại nhánh mở của lô LTT300 khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở cả 2 thời điểm 30 phút (P<0,05) và 60 phút (P<0,01).
Ghi chú: * Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,05) ** Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,01)
Hình 3.13: Biểu đồ so sánh số lần ra nhánh mở bằng MH CTNC thời điểm sau 30 phút
Kết quả thử nghiệm trên mô hình chữ thập nâng cao cho thấy: cả 2 liều LTT150 và LTT300 đều thể hiện tác dụng an thần giải lo âu trên chuột nhắt sau khi uống 30 phút và 60 phút. Trong đó, liều 150 mg/kg sau 30 phút uống thuốc và 300mg/kg sau 60 phút uống thuốc có khác biệt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01). * * ** * * **
Hình 3.14: Biểu đồ so sánh số lần ra nhánh mở bằng MH CTNC thời điểm sau 60 phút
3.3.4 Kết quả thử nghiệm mô hình hai ngăn sáng tối
Bảng 3.14 Kết quả thử nghiệm mô hình hai ngăn sáng tối (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lô thử nghiệm
Số lần và % chuột ra ngăn sáng
Tổng thời gian và % chuột lƣu lại ngăn sáng
P Lô chứng 5,77 ± 1,09 32,22% ± 1,68 1:45 ±0,02 35,11% ± 11 >0,05 Lô Diazepam 8,37 ± 3,9 * 33,38 % ± 3,5 2: 34 ± 0,02* 51,63 % ± 8,25 < 0,05 Lô LTT150 7,28 ± 3,7 33,64% ± 2,7 2:44 ± 0,03* 54,69 % ± 13,9 < 0,05 Lô LTT300 6,17 ± 1,73 32,72% ± 9,5 2:06 ±0,03 42% ± 18,6 > 0,05 Kết quả :
Kết luận : So với nhóm chứng, chỉ có Diazepam liều 2 mg/kg ( p.o) có tác dụng làm tăng thời gian ở ngăn sáng của lô chuột thử nghiệm có ý nghĩa thống kê ( p < 0,05).Tuy nhiên tổng thời gian chuột lƣu lại ngăn sáng ở lô DZP và LTT150 tăng có ý nghĩa thống kê với lô chứng.Trong khi tổng thời gian lƣu lại ngăn sáng của LTT300 tăng nhƣng không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
Kết luận : Nhƣ vậy Lạc tiên tây ở liều 150 mg/kg và 300 mg/kg cao cồn Lạc tiên tại thời điểm 60 phút sau khi uống thuốc làm tăng thời gian lƣu lại ngăn sáng của chuột, nhƣng duy nhất liều LTT150 khác biệt có ý nghĩa thống kê, chứng tỏ ở liều này lạc tiên tây thể hiện tác dụng an thần giải lo âu.
Hình 3.15 : Biểu đồ thể hiện số lần chuột ra ngăn sáng
Hình 3.16: biểu đồ thể hiện thời gian chuột lưu lại ngăn sáng
3.3.5 Kết quả thử nghiệm độc tính bán trƣờng diễn
Trong suốt thời gian thí nghiệm, chuột ở cả 3 lô (1 lô chứng và 2 lô thử nghiệm) đều hoạt động bình thƣờng, nhanh nhẹn, lông mƣợt, mắt sáng, ăn uống
tốt, phân khô, không thấy bất kỳ biểu hiện gì đặc biệt ở cả 3 lô chuột trong suốt 8 tuần nghiên cứu.
Sau 8 tuần uống cao chiết Lạc tiên tây 2 liều 150mg/kg chuột và 300mg/kg chuột, tất cả các xét nghiệm đánh giá chức năng tạo máu (số lƣợng hồng cầu, hàm lƣợng hemoglobin, số lƣợng bạch cầu) không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng và giữa các thời điểm trƣớc và sau khi uống thuốc ( p > 0,05). Quan sát đại thể sau 8 tuần uống cao chiết Lạc tiên tây liều 300mg/kg chuột và liều 600mg/kg chuột: Giải phẫu tất cả các lô để quan sát đại thể các tạng phủ của chuột, không thấy bất kỳ thay đổi bệnh lý nào về hình thái đại thể của các cơ quan tim, gan, thận, bàng quang và hệ tiêu hóa.
Chỉ số ure và creatin của 1 lô LTT150 và LTT300 khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng. Có 1/5 mẫu thận có biểu hiện viêm thận kẽ mạn ở cả hai liều thử nghiệm.
Bảng 3.15: Chỉ số huyết học, sinh hóa của chuột nhắt sau 60 ngày dùng thuốc
Chỉ số Chứng LTT150 LTT300 Hồng cầu (triệu/mm3) 9,19 ± 2,1 6,99 ± 2,7 76,06% 7,46 ±2,4 81,17% Bạch cầu (triệu/mm3) 9,55 ± 0,4 9,41 ± 2,0 98,53% 9,46 ± 2,0 99,05% Hb (%) 152 ± 11,2 146,56 ± 32,4 96,42% 142,11 ± 32,8 93,49% Ure (mg/dL) 11,64 ±2,0 13,99 ± 2,4* 120,2% 14,54 ± 2,4* 124,9% Creatin (mg/dL) 67,0 ± 4,3 74,67 ± 8* 111,4% 68,11 ± 3,9 101,6%
AST (U/L) 132,67 ±41,5 113,22 ± 17,0 85,33% 117,33 ± 23,0 88,43% ALT (U/L) 94,11 ± 38,9 76,00 ± 12,0 80,76% 77,67 ± 16,0 82,53% Ghi chú: * Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,05)
a. thận bình thƣờng b. viêm thận kẽ mãn c. Gan bình thƣờng
Hình 3.17 Hình ảnh mô học gan thận chuột nhắt trắng sau 8 tuần uống thuốc lô thử nghiệm
a. Tế bào thận bình thƣờng b. Tế bào gan bình thƣơng
Hình 3.18 Hình ảnh mô học gan thận lô chứng
Nhận xét chung
Dƣợc liệu sử dụng trong nghiên cứu đạt yêu cầu về độ tinh khiết (độ ẩm, độ tro) và các tính chất lý hóa cơ bản thông qua các phản ứng định tính hóa học, sắc ký lớp mỏng, đã xác định sự hiện diện của các flavonoid và vitexin trong mẫu nghiên cứu. Định lƣợng bằng phƣơng pháp cân và phƣơng pháp quang phổ đã xác định hàm lƣợng flavonoid toàn phần là 0,986 % và flavonoid tính theo vitexin là 0,617 %. Đây là những tiền đề cần thiết để tiến hành các thử nghiệm về tác dụng dƣợc lý thực nghiệm và lâm sàng tiếp theo.
Về phƣơng pháp chiết xuất
Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng, định lƣợng flavonoid toàn phần, và định lƣợng vitexin cho thấy ngâm kiệt với dung môi cồn 60 % trong điều kiện nhiệt độ thƣờng đã chiết xuất đƣợc gần nhƣ toàn bộ các hoạt chất nhóm flavonoid, trong đó có vitexin. Đây là phƣơng pháp chiết xuất đơn giản, dễ triển khai ở các quy mô sản xuất nhỏ và lớn.
Về tính an toàn của cao Lạc tiên tây
Trong thử nghiệm độc tính cấp, liều cao nhất có thể đƣa thuốc qua kim đầu tù là 3,2 g cao thuốc / kg chuột (tƣơng đƣơng liều ở ngƣời là 14,88 g/kg, tƣơng đƣơng 44,4 g dƣợc liệu). Ở liều này, thuốc ở dạng hỗn dịch rất đậm đặc vừa đủ qua đầu kim để có thể bơm thuốc vào dạ dày chuột. Sau khi uống thuốc, chuột vẫn ăn uống, hoạt động và bài tiết bình thƣờng, không có biểu hiện ngộ độc ở chuột và không có chuột nào chết trong vòng 72 giờ và suốt 2 tuần tiếp theo sau khi uống thuốc. Mặc dù chƣa xác định đƣợc độc tính cấp và chƣa tính đƣợc LD50 của cao Lạc tiên tâu, nhƣng từ liều Dmax = 3,2 g/kg chúng tôi đã chọn đƣợc 2 liều cho các thử nghiệm dƣợc lý tiếp theo là 150 mg/kg (tƣơng dƣơng 1/20 Dmax) và 300 mg/kg (tƣơng đƣơng 1/10 Dmax). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau 2 tháng uống cao chiết Lạc tiên tây hai liều LTT150 và LTT300, các chỉ số hồng cầu, bạch cầu, Hb, AST, ALT, cấu trúc vi thể gan của chuột không khác biệt so với nhóm uống nƣớc cất. Tuy nhiên, chỉ số ure tăng 20,2 %, creatinin tăng 11,14% và có 1/5 chuột ở cả hai lô thử nghiệm LTT150 và LTT300 bị viêm thận kẽ mạn. Cần có những nghiên cứu kỹ lƣỡng hơn để đánh giá về tính an toàn với chức năng thận của dƣợc liệu này. Trong đó, cần chú trọng những nghiên cứu về liều dùng tối ƣu của Lạc tiên tây.
Về tác dụng an thần, giải lo âu của cao Lạc tiên tây
Với mục tiêu nghiên cứu của đề tài là khảo sát tác dụng an thần của Lạc tiên tây, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tác dụng hiệp đồng thiopental (40 mg/kg, IV) theo mô hình của các nghiên cứu trƣớc đây [44], [45] ,[15], [26]. Loại barbituric có thời gian bán thải ngắn nên dùng đƣợc để khảo sát tác dụng hiệp lực kéo dài thời gian ngủ của các thuốc an thần gây ngủ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, LTT300 sau uống 60 phút đã kéo dài thời gian ngủ mê của chuột có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
Với mục tiêu nghiên cứu tác dụng an thần giải lo âu, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm trên mô hình chữ thập nâng cao, đây là mô hình khá đơn giản và đƣợc áp dụng trong nhiều nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc [46]
với thuốc đối chiếu là Diazepam (2 mg/kg, uống). Kết quả cho thấy số lần ra nhánh mở và lƣu lại nhánh mở của chuột uống diazepam khá tƣơng đồng với những công bố trƣớc đây của tác giả trong và ngoài nƣớc. Đồng thời, với 2 liều nghiên cứu LTT150 và LTT300 Lạc tiên tây đều làm tăng số lần ra nhánh mở và tăng thời gian lƣu lại tại nhánh mở của chuột thử nghiệm có ý nghĩa thống kê. Đây là những cơ sở đáng tin cậy để chứng minh tác dụng an thần giải lo âu của cao chiết từ Lạc tiên tây trống tại Việt Nam.
Đồng thời, để khẳng định lại tác dụng an thần giải lo âu, chúng tôi cũng tiến hành thử nghiệm trên mô hình đen trắng, đây cũng là mô hình đƣợc áp dụng trong nhiều nghiên cứu trong và ngoài nƣớc cũng với thuốc đối chiếu là Diazepam (2 mg/kg , uống ). Kết quả cho thấy, số lần chuột ra ngăn sáng tăng nhƣng không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ( p > 0,05) và thời gian chuột lƣu lại ngăn sáng của lô DZP tăng 16,52 % và lô LTT150 tăng 19,58 % có ý nghĩa thống kê so với lô chứng ( p < 0,05). Kết quả này cũng là cơ sở đáng tin cậy để chứng minh tác dụng an thần giải lo âu của cao chiết từ Lạc tiên tây.
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận
- Đã khảo sát một số tiêu chuẩn hóa lý của dƣợc liệu Lạc tiên tây trồng tại Việt Nam: độ ẩm (8,982 %), tro toàn phần (0,149 %), tro không tan trong acid hydro cloric (0,006 %), định tính flavonoid, alkaloid bằng phƣơng pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng, flavonoid toàn phần (0,986 %), vitexin (0,617 %).
- Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng của cao Lạc tiên tây: độ ẩm (17,67 % ), tro toàn phần (0,216 %), định tính flavonoid, alkaloid bằng phƣơng pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng, flavonoid toàn phần (2,882 %), vitexin ( 2,087 %).
- Ở liều uống LTT300, cao cồn Lạc tiên tây có tác dụng kéo dài thời gian ngủ của Thiopental (40 mg/kg, IV).
- Với thử nghiệm mô hình chữ thâp nâng cao, ở liều uống LTT150 và LTT300 , cao cồn Lạc tiên tây thể hiện tác dụng an thần giải lo âu trên chuột nhắt trắng.
- Tác dụng trên mô hình đen trắng , ở liều LTT150 làm tăng thời gian chuột lƣu lại ngăn sáng, khẳng định liều này có tác dụng an thần giải lo âu.
- Đã xác định Dmax đƣờng uống trên chuột nhắt trắng là 3,2 g/kg
- Ở liều LTT150 và LTT300, uống 60 ngày, cao Lạc tiên tây không làm thay đổi số lƣợng hồng cầu, bạch cầu, hemoglobin, AST, ALT, vi thể gan, nhƣng làm tăng chỉ số ure, creatinin và thay đổi hình thái vi thể mô học thận của chuột nhắt trắng ở hai lô thử nghiệm LTT150 và LTT300.
4.2. Đề nghị
- Bảng tiêu chuẩn cơ sở Lạc tiên tây
STT Các tiêu chí Mức chất lƣợng
1 Soi bột Lỗ khí, mạch chấm đồng tiền, mảng biểu bì, lông che chở, mảnh nhựa calci oxalat, mạch vạch, mạch mạng, lông tiết
2 Độ ẩm Không đƣợc quá 10 %
3 Độ tro toàn phần Không đƣợc quá 2 % 4 Độ tro không tan trong
acid HCl Không đƣợc quá 2 % 5 Định tính: 1. Phản ứng hóa học 2. Sắc ký lớp mỏng
Dƣợc liệu phải cho phản ứng với : o Bột Mg và HCl có màu đỏ cam o Thuốc thừ Mayer o Thuốc thử Bouchardat o Thuốc thử Dragendorff Các vết thu đƣợc trên sắc kí đồ của dƣợc liệu phải có giá trị Rf và màu sắc tƣơng đồng với vết thu đƣợc của chuẩn vitexin
6 Định lƣợng Hàm lƣợng flavonoid toàn phần theo phƣơng pháp cân
0,9%
Hàm lƣợng flavonoid toàn phần tính theo vitexin 0,6% - Bảng tiêu chuẩn cơ sở cao Lạc tiên tây
STT Các tiêu chí Mức chất lƣợng
1 Độ ẩm Không đƣợc quá 20%
2 Độ tro toàn phần Không đƣợc quá 2% 3 Định tính:
3. Phản ứng hóa học
4. Sắc ký lớp mỏng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cao phải cho phản ứng của hợp chất flavonoid Các vết thu đƣợc trên sắc
kí đồ của mẫu thử phải có giá trị Rf và màu sắc tƣơng đồng với vết thu đƣợc của
o Nguyên liệu Lạc tiên
o Chuẩn vitexin
4 Định lƣợng Hàm lƣợng flavonoid
toàn phần theo phƣơng pháp cân 2,8%
Hàm lƣợng flavonoid tính theo vitexin 2%
- Nghiên cứu liều tối ƣu có tác dụng an thần giải lo âu