4. MỘT SỐ MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG AN THẦN GIẢI LO ÂU
2.3Thử độc tính cấp
2.3.2 Súc vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng, giống đực, chủng Swiss albino, 5- 6 tuần tuổi, khối lƣợng từ 18 – 22 g, đƣợc cung cấp bởi Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh.
Chuột đƣợc nuôi ổn định trong lồng nhựa (28 cm × 17cm ×14cm) bằng thức ăn cám viên với thành phần bột gạo, bột bắp và vitamin bổ sung một tuần trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Số lƣợng: mỗi lồng 6- 8 con. Chuột đƣợc nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng với chu kỳ 12 giờ sáng và 12 giờ tối.
2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Nguyên tắc Nguyên tắc
Chuột nhắt trắng đƣợc chia làm các nhóm tƣơng tự. Những chuột ở cùng nhóm sẽ nhận cùng một liều chất khảo sát nhƣng các liều này sẽ thay đổi theo từng nhóm chuột. Sự đánh giá kết quả dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết) nhận thấy ở mỗi chuột trong nhóm. Nên chọn liều ở cấp số nhân để đƣợc lgarit của liều ở cấp số cộng.
Quan sát và ghi kết quả
Ghi các biểu hiện độc và mức độ nghiêm trọng: sự xuất hiện độc tính, tiến triển và phục hồi hoặc chết qua từng thời gian của từng nhóm.
Thời gian theo dõi là thời gian mà động vật thí nghiệm còn có biểu hiện độc và chết do thuốc gây nên.Thông thƣờng nếu uống cần thời gian là 72 giờ.
Các con vật chết trong thời gian quan sát, phải mổ xem các chết do nguyên nhân gì. Những con vật còn sống sau thời gian theo dõi cũng nên mổ xem các tạng phủ và cơ quan trong cơ thể có những thay đổi bất thƣờng gì không.
Trƣờng hợp không xác định đƣợc LD50: Về nguyên tắc, khi xác định độc tính cấp là phải xác định LD50. Tuy nhiên cũng có những trƣờng hợp không xác định đƣợc LD50. Có nhiều thuốc cho uống với liều rất cao mà con vật không chết. Một con chuột nhắt, chỉ có thể cho uống với thể tích tối đa một lần là 1ml. Cao dƣợc liệu chỉ có thể cô đến mức độ nào đó, nếu cô quá sẽ thành cao đặc và không thể qua kim để cho uống đƣợc. Có thể gặp hai trƣờng hợp:
Đã thử đến liều có động vật thí nghiệm chết, nhƣng không có liều nào đạt mức gây chế 100% hoặc gần tới 100%. Khi đó, tuy không xác định đƣợc LD50, nhƣng ta vẫn xác định đƣợc liều tối đa mà không có con vật nào chết, gọi là liều dƣới liều chết (infralethal dose) và đƣợc ký hiệu là LD0. Trong nghiên cứu để xác định LD50 thì thông thƣờng gấp 2 – 3 lần LD0. Vì vậy liều tƣơng đối an toàn Ds
dùng cho thực nghiệm dƣợc lý ban đầu đƣợc lấy giá trị 1/5 LD0(nếu xác định đƣợc LD50 thì liều Ds bằng 1/10LD50)
Trƣờng hợp tất cả các liều thử nghiệm đều không có con vật nào chết, thì liều lớn nhất đã thử Dmax chƣa chắc là liều LD50 và liều tƣơng đối an toàn Ds dùng cho thực nghiệm dƣợc lý ban đầu có thể bằng 1/10Dmax hoặc lớn hơn Dmax là tùy theo kinh nghiệm của nhà nghiên cứu dƣợc lý.
Điều kiện thí nghiệm
Thuốc thử: Cao chiết Lạc tiên tây đƣợc hòa vào nƣớc cất.
Dụng cụ thí nghiệm: Kim đầu tù để cho uống, dụng cụ mổ, dụng cụ pha thuốc. Chuẩn bị động vật thí nghiệm: Chuột mua về đƣợc ổn định trong khoảng thời gian 1 tuần trƣớc thử nghiệm, đƣợc cung cấp đầy đủ thức ăn và nƣớc uống.
Đƣờng dùng thuốc: Uống (p.o) Thể tích uống: 10 ml/kg thể trọng.
Số lần dùng thuốc: Dùng một lần duy nhất trong ngày trong khoảng thời gian 8-9 giờ sáng.
Phƣơng pháp thử
Để thăm dò liều ban đầu, phải thực hiện qua 2 giai đoạn:
- Giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều là 6 chuột) - Giai đoạn xác định
Phải theo dõi các lô thật chặt chẽ trong 72 giờ đầu sau khi uống thuốc, Sau đó thấy cần thiết thì theo dõi tiếp trong suốt 2 tuần tiếp theo.
Thử nghiệm sơ khởi
Dùng 6 con chuột với liều nào đó, với thể tích tối đa là 10 ml/kg chuột. Nếu kết quả chết cả 6 con thì thăm dò với 6 con khác liều giảm một nửa. Nếu cả 6 con đều sống thì cũng thăm dò với 6 con khác nhƣng liều tăng lên gấp đôi.
Thăm dò nhƣ vậy cho đến khi tìm đƣợc một liều làm chết 50 % con vật thì lấy liều đó làm liều cơ sở, rồi dùng một số liều lớn hơn theo bƣớc nhảy liều cho đến liều làm chết tất cả các con vật thử nghiệm và dùng một số liều nhỏ hơn theo bƣớc nhảy liều cho đến khi thầy một liều làm tất cả các con đều sống. Từ đó ta sẽ tìm đƣợc:
- Liều tối đa dung nạp không có súc vật chết (d1) - liều tối thiểu làm chết tất cả thú vật thử nghiệm (d2)
(d1) (d2) là giới hạn khoảng các mà từ đó ta phải tìm những liều để thử nghiệm xác định
Dùng khoảng 6 lô chuột, mỗi lô 10 con. Ở những liều gần LD50 nên gia tăng số lƣợng súc vật để đo lƣờng đƣợc chính xác hơn.
Liều ở khoảng cách 6 lô (d1) và (d2) nên chọn cấp số nhân. Quan sát súc vật trong vòng 72 giờ sau khi cho uống thƣớc để ghi nhận số súc vật chết, sống trong mỗi lô và tiếp tục theo dõi trong suốt hai tuần tiếp theo.
Chỉ tiêu đánh giá kết quả
Theo dõi sát sao 72h sau khi dùng thuốc.Sau đó theo dõi 2 tuần tiếp theo. Ghi chép đầy đủ chi tiết mỗi biến trong thời gian đó. Ghi giờ cho uống thuốc, giờ xuất hiện các triệu chứng khác thƣờng, giờ chuột chết (nếu có) và tình trạng ngộ độc trƣớc và khi chuột thí nghiệm chết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ghi nhận số súc vật chết trong từng lô, lập bảng phân suất tử vong.
Xét nghiệm đại thể sau khi chết đối với chuột bị chết và làm xét nghiệm đại thể sau khi kết thúc thử nghiệm đối với súc vật còn sống. Xác định LD50 theo phƣơng pháp Karber – Behrens.
Bảng 2.1 Các hành vi của chuột cần chú ý trong thời gian theo dõi
Hệ thống cơ quan Quan sát và thử nghiệm Dấu hiệu chung của độc tính Hệ thống thần
kinh trung ƣơng và hệ vận động
Hành vi Hung hăng, phát âm khó khăn, bồn chồn, tê dại
Vận động Co giật, tê liệt, run, mất điều hòa, sự giảm trƣơng lực cơ, liệt cơ, tăng co thắt cơ.
Phản ứng lại các kích thích khác
Dễ kích thích, thụ động, mất cảm giác (gây tê, mê), tăng cảm giác.
Hệ thần kinh thực vật
Phản ứng não và tủy sống Chậm chạp, lờ đờ, mất cảm giác Trƣơng lực cơ Co cứng hay mềm nhũn
Kích thƣớc đồng tử Giãn đồng tử, co đồng tử
Lỗ mũi Chảy nƣớc mũi(có màu hay
không)
Hệ hô hấp Đặc tính và tốc độ Nhịp thở chậm
Hệ tim mạch Dấu hiệu của tim mạch Hồi hộp, rung động, nhịp tim chậm, loạn nhịp tim, nhịp đập nhanh hơn hoặc yếu
Dạ dày ruột Các triệu chứng Tiêu chả, táo bón
Hình dáng bụng Đầy hơi, teo ruột, tăng co bóp Độ chắc và màu sắc của
phân
Không điển hình hoặc phân đen
Cơ quan sinh dục Dƣơng vật Sa xuống
Da và lông Màu, tình trạng ửng đỏ, phát ban, da nhăn, xù lông
Màng mày Màng kết, miệng Tiết dịch, xung máu, xuất máu, chứng xanh xám,bệnh vàng da.
Mắt Mi mắt
Nhãn cầu Tính trong suốt
Sa mi mắt, lồi nhãn cầu, co giật giãn cầu, bị mờ đục
Vị trí tiêm thuốc Sƣng tấy
Tình trạng chung Điệu bộ bất thƣờng, gầy yếu
2.4 Thử tác dụng hiệp đồng với thiopental 2.4.1 Súc vật thử nghiệm 2.4.1 Súc vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, 5- 6 tuần tuổi, khối lƣợng từ 18 – 22 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
g, đƣợc cung cấp bởi Viện Parteur TH Hồ Chí Minh. Chuột đƣợc nuôi bầy trong bocal và đƣợc đảm bảo chu kỳ 12/12 giờ sáng tối (5g00 –17g00 là chu kỳ sáng).
Chuột đƣợc làm quen với điều kiện phòng thử nghiệm ít nhất 24 giờ. Tất cả các thử nghiệm đƣợc tiến hành giữa trong khoảng 8 giờ-16 giờ.
2.4.2 Hóa chất
Thiopental Injection BP 1G của nhà sản xuất Rotexmedia Tritau Germany. Thiopental là một thuốc ngủ thuộc nhóm thiobarbital
Cơ chế : Ức chế những chức phận của hệ lƣới và vai trò là dẫn dắt và chọn lọc những thống tin từ ngoài biên vào vỏ não. Do trong cấu trúc của thiopental nguyên tử oxy ở carbon thứ hai đƣợc thay thế bằng lƣu huỳnh nên thuốc này có tác dụng gây mê nhanh và ngắn. Thiopental còn đƣợc dùng làm chất tiền mê trong các cuộc phẫu thuật. Đƣờng sử dụng : Tiêm tĩnh mạch dung dịch thiopental sodium.
2.4.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành 3 lô, nuôi ổn định 1 tuần trƣớc khi thử nghiệm (n = 10)
Lô thử 1 : Uống cao chiết Lạc tiên tây liều 1/20Dmax Lô thử 2 : Uống cao chiết Lạc tiên tây liều 1/10 Dmax
Sau uống 60 phút, tiêm tĩnh mạch thiopental 40 mg/kg cho chuột. Chỉ tiêu theo dõi: thời gian ngủ mê, tiềm thời
- Thời gian ngủ mê: tính từ lúc chuột mất phản xạ thăng bằng cho đến khi chuột có lại phản xạ thăng bằng.
- Tiềm thời: tính từ lúc tiêm phúc mô thiopental đến khi chuột mất phản xạ thăng bằng
2.5 Thử tác dụng an thần giải lo âu với mô hình chữ thập nâng cao 2.5.1 Súc vật thử nghiệm 2.5.1 Súc vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, 5- 6 tuần tuổi, khối lƣợng từ 18 – 22 g, đƣợc cung cấp bởi Viện Parteur TH Hồ Chí Minh.
2.5.2 Hóa chất
Diazepam (V.pharma)
2.5.3 Dụng cụ thí nghiệm
Mô hình chữ thập cho chuột nhắt bao gồm hai nhánh mở (25 ×5 cm) vuông góc với hai nhánh đóng (25 ×5 × 10 cm) đƣợc nối với nhau bằng một vùng trung tâm (5×5 cm) và nâng cao 80 cm so với mặt đất và đƣợc chiếu sáng 100lux. Ngoài rìa của nhánh mở có mồ gờ cao 0,25cm để giảm khả năng chuột rơi khỏi mô hình.
Hình 2.1 Mô hình chữ thập nâng cao
2.5.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên 4 lô, mỗi lô 10 chuột: Lô chứng: uống nƣớc cất 0,2 ml/10g chuột Lô đối chiếu: uống Diazepam liều 2 mg/kg chuột Lô thử 1 : Uống cao chiết Lạc tiên tây liều 1/20Dmax Lô thử 2 : Uống cao chiết Lạc tiên tây liều 1/10 Dmax
30 phút hoặc 60 phút sau khi cho uống thuốc, chuột đƣợc đặt nhẹ nhàng vào trung tâm mô hình hƣớng đầu vào cánh tay mở trong 5 phút để theo dõi thời gian chuột ở từng ngăn. So sánh số lần chuột ra cánh tay mở, cánh tay đóng và tổng thời gian chuột ở cánh tay mở, cánh tay đóng. Sau mỗi thử nghiệm, mô hình đƣợc lau chùi sạch và 5 phút sau tiếp tục thử tiếp.
2.5.5 Điều kiện thí nghiệm
Chuột đƣợc thử nghiệm vào khoảng 8 – 9 giờ sáng hàng ngày, mỗi ngày đo 2 chuột mỗi lô, bảo đảm thời gian, không gian và điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, tiếng ồn là tƣơng đồng nhau giữa các thời điểm đo và các lô thử nghiệm, hạn chế sự tác động của môi trƣờng lên kết quả thí nghiệm.
2.6 Thử tác dụng an thần giải lo âu với mô hình đen trắng 2.6.1. Súc vật thử nghiệm 2.6.1. Súc vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, 5- 6 tuần tuổi, khối lƣợng từ 18 – 22 g, đƣợc cung cấp bởi Viện Parteur TH Hồ Chí Minh.
2.6.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Thiết bị thử nghiệm Panlab Black and White box – Tây Ban Nha đƣợc thực hiện trong mộ hộp nhựa Perpex đƣợc chia thành hai ngăn sáng ( 250 ×250 × 240mm, lắp bong đèn trắng 100W) và ngăn tối ( 160 ×250 ×240 mm, lắp bóng đèn đỏ 40W). Hai bóng đèn cách sàn 370mm. Hai ngăn thông nhau bởi một cửa có kích thƣớc 70× 70 mm ở bên dƣới, chính giữa hộp. Thời gian và số lần chuột di chuyển vào các ngăn đƣợc máy tính ghi nhân thông qua phần mềm chuyên dụng ( PPC Win v2.0.03)
Chuột đƣợc chia làm 4 lô nhƣ sau :
Lô chứng: Uống nƣớc cất 0,2 ml/10g chuột Lô đối chiếu: Uống Diazepm liều 2 mg/kg chuột Lô thử 1: Uống cao chiết Lạc tiên tây liều1/20 LD50 Lô thử 2: Uống cao chiết Lạc tiên tây liều 1/10 LD50
Chuột đƣợc đặt ở cửa ngăn cách vùng sáng và vùng tối, hƣớng ra ngăn sáng. Sau đó chuột đƣợc khám phá tự do trong 5 phút. Ghi nhận lại số lần ra vào vùng sáng của chuột và thời gian ở vùng sáng. Chuột đƣợc tính là ra vùng sáng khi cả 4 chân vƣợt qua lằn phân cách. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ghi nhận tại thời điểm 60 phút sau khi chuột uống thuốc đối với các lô.
Hinh 2.2 Hình ảnh mô hình đen trắng
2.7. Thử độc tính bán trƣờng diễn 2.7.1 Súc vật thử nghiệm 2.7.1 Súc vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, 5- 6 tuần tuổi, khối lƣợng từ 18 – 22 g, đƣợc cung cấp bởi Viện Parteur TH Hồ Chí Minh.
2.7.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 10 chuột: Lô chứng: Uống nƣớc cất 0,2 ml/10g chuột
Lô thử 2: Uống cao chiết Lạc tiên tây liều 1/10 Dmax
Thời gian dùng thuốc là 60 ngày. Cuối thử nghiệm, lấy máu xác định các thông số
Huyết học: Số lƣợng hồng cầu, số lƣợng bạch cầu, Hct, Hb Chức năng gan: Transaminase (AST, ALT)
Chức năng thận: Creatinin và ure trong máu
Giải phẫu chuột, quan sát sự thay đổi về hình thái đại thể các cơ quan nội tạng và vi thể gan, thận.
2.8 Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu
Số liệu thực nghiệm đƣợc biểu diễn dƣới dạng trung bình ± sai số chuẩn (M ± SD). Dùng phép kiểm T-test và anova một yếu tố với phần mềm Minitab 15.0 để so sánh ý nghĩa thống kê. Vẽ đồ thị bằng chƣơng trình Microsoft Excel 2007.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tiêu chuẩn dƣợc liệu
* Cảm quan
Đoạn thân dài 3 – 5 cm, mang tua cuốn và lá, có lẫn hoa. Thân và lá có nhiều lông, phiến lá mỏng, màu hơi vàng nâu, dễ vụn nát, mép lá có răng cƣa, gốc lá hình tim, tua cuống ở nách lá.
* Độ ẩm
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ ẩm dược liệu Lạc tiên tây
Mẫu thử Độ ẩm (%) Trung bình (%)
Lần 1 8,994
8,982 ± 0,015
Lần 2 8,988
Lần 3 8,965
Nhận xét: Độ ẩm của dƣợc liệu Lạc tiên tây là 8,982 % .
* Độ tro
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát tro toàn phần dược liệu Lạc tiên tây
Mẫu thử Tro toàn phần (%) Trung bình (%)
Mẫu 1 0,148
0,149 ± 0,003
Mẫu 2 0,148 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu 3 0,152
Nhận xét: Tro toàn phần của dƣợc liệu Lạc tiên tây là 0,149 % ( < 2 % ).
Mẫu thử Tro không tan trong HCl (%) Trung bình (%)
Mẫu 1 0,006
0,006
Mẫu 2 0,006
Mẫu 3 0,006
Nhận xét: Tro không tan trong acid của dƣợc liệu Lạc tiên tây là 0,006 % .
* Soi bột dƣợc liệu
Trong bột nguyên liệu Lạc tiên tây có sự hiện diện của lông che chở đơn bào có gai, lông tiết, mảng biểu bì có chứa lỗ khí, mảnh nhựa, có chứa tinh thể canxi oxalate hình cầu gai, có mạch mạng, mảch vạch và mạch ngăn chấm đồng tiền. Phù hợp với những đặc điểm vi học điển hình của Lạc tiên tây đã đƣợc mô tả trong Dƣợc điển Châu Âu.
g. Mạch mạng h. Lông tiết
Hình3.1: Đặc điểm soi bột Lạc tiên tây
* Vi phẫu Vi phẫu lá
- Gân giữa: Gân trên lồi hơn nhiều so với gân dƣới. Cấu tạo gân lá khá đơn giản. Bên ngoài là lớp biểu bì tẩm cutin, kế đến là 3- 4 lớp tế bào mô dày góc, đặc biệt ở gân trên của lá mô dày gần nhƣ chiếm toàn bộ phần diện tích gần trên. Kế đến lớp mô dày và kéo dài vào đến hết vùng tủy là mô mềm đạo. Vùng tủy có từ 3- 4 bó
a. Mạch chấm đồng tiền b. Lỗ khí c. Mảnh biểu bì
d. Lông che chở e. Mảnh nhựa, canxi oxalate f. Mạch vạch
libe – gỗ xếp thành hình vòng cung gaần tròn với libe bên ngoài, gỗ bên trong. Các tế bào mô mềm ở gần lớp mô dày và các tế bào nằm trong vùng libe thƣờng chứa