4. Giới thiệu về vi khuẩn Azotobacter
1.2. Dụng cụ và thiết bị
- Hộp nhựa PP chịu nhiệt kích thước 10x20cm.
- Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, becher, ống đong, chai nước biển các loại.
- Que cấy, que trang, đèn cồn, pipitte. - Buồng đếm hồng cầu. - Kính hiển vi. - Tủ sấy, tủ cấy. - Cân phân tích. - Máy sục khí. - Autoclave. - Hĩa chất cần thiết. 1.3.Mơi trường
MT 1 (mơi trường Hansen): nuơi cấy và giữ giống nấm men. - Glucose : 50g - Peptone : 10g - KH2PO4 : 3g - MgSO4.7H2O : 3g - Nước cất : 1 lít - Agar : 20g pH = 6,0
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 37
MT 2 (mơi trường nhân sinh khối nấm men) - Mật rỉ đường : 80g
- (NH4)2HPO4 : 2g - MgSO4.7H2O : 1g - Nuớc cất : 1lít
MT 3 (mơi trường Ashby): nuơi cấy Azotobacter
- Glucose : 20g - K2HPO4 : 0,2g - NaCl : 0,2g - MgSO4.7H2O : 0,2g - CaSO4.2H2O : 0,1g - CaCO3 : 5g - Nước cất : 1lít pH = 7,4 – 7,6
MT 4 (mơi trường nhân giống Acetobacter xylinum)
- (NH4)2SO4 : 8g - (NH4)2HPO4 : 2g - Yeast extract : 2g - Glucose : 20g - Nước dừa già : 1lít - Acid acetic : 5ml
MT 5 (mơi trường lên men thu BC) - (NH4)2SO4 : 8g - (NH4)2HPO4 : 2g - Saccharose : 20g - Nước dừa già : 1lít - Acid acetic : 5ml
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 38
2. Phương pháp tiến hành
2.1. Nhân giống A. xylinum để thu cellulose vi khuẩn (BC)
Mục đích: tạo miếng BC để làm giá đỡ nuơi cấy vi sinh vật.
Các bước thực hiện:
Thu BC
Nhân giống cấp 2 Nhân giống cấp 1
Lên men tĩnh 4 ngày Cấy giống
Tỉ lệ V giống : V(MT5)= 1: 10
Nhân giống cấp 3 Giống từ mơi trường
giữ giống
Xử lý BC Nước dừa già
Lọc + bổ sung hĩa chất
Đun sơi 15 phút
Bổ sung acid acetic đậm đặc Để nguội đến nhiệt
độ phịng
Phối ra hộp nhựa
Cấy vào 5ml mơi trường hoạt hĩa [MT4] trong 24 giờ
Hút 10ml giống cấp 1 vào bình 100ml
mơi trường [MT4] để 24 giờ
Hút 20ml giống cấp 2 vào bình 200ml mơi trường [MT4] để 24 giờ
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 39
Phương pháp xử lý BC tươi sau khi thu hoạch
Mục đích: BC sau khi xử lý được sử dụng làm giá đỡ nuơi cấy tế bào vi sinh vật.
Yêu cầu: BC tươi thu được sau lên men cĩ độ ngậm nước khá cao. Trong BC chứa một lượng lớn mơi trường lên men và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất (acid acetic, …), do đĩ xử lý BC phải đạt các yêu cầu sau:
- Cĩ tính chất cơ lý bền vững, ổn định để chịu được các tác động của mơi trường như khuấy trộn, các áp lực …
- Sạch và cĩ thể khử trùng. - Loại bỏ hồn tồn các tạp chất.
Phương pháp:
- Phương pháp 1: đun BC với NaOH 3% ở 100°C trong 30 phút. Trung hịa bằng HCl 5%.
- Phương pháp 2: ngâm BC với NaOH 3% trong 12 giờ. Trung hịa bằng HCl 5%.
- Phương pháp 3: BC thơ thu được sau lên men cĩ độ ẩm 90% - 92%
Ngâm nước: thời gian 24 giờ, thay nước 4 lần → vắt lần 1: thời gian 10 phút, tốc độ vắt 100 – 200vịng/phút, ẩm độ sau khi vắt 50 – 55% → ngâm nước cho trương nở trở lại: thời gian 24 giờ, thay nước 4 lần → vắt lần 2: thời gian 10 phút, tốc độ vắt 100 – 200vịng/phút, ẩm độ sau khi vắt 50 – 55%.
Sấy: nhiệt độ 40°C trong 10 giờ, độ ẩm sau khi sấy là 12 – 15%.
Khử trùng: ở nhiệt độ 121°C trong 15 – 20 phút.
- Phương pháp 4: ngâm với NaOH 3% trong 2 giờ. Trung hịa bằng HCl 5%. Lặp lại phương pháp 3.
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 40
Lựa chọn phương pháp xử lý BC thích hợp, sau đĩ sấy miếng BC cho ráo bớt nước, cân trọng lượng sau khi sấy và hấp khử trùng ở 121°C, 1atm trong 15 phút.
2.2. Khảo sát khả năng tăng trưởng của các chủng nấm men trên giá đỡ BC giá đỡ BC
2.2.1. Xác định mật độ tế bào ban đầu của các chủng nấm men
Mục đích :
Điều chỉnh mật độ tế bào ban đầu của các chủng nấm men sao cho tương đối bằng nhau để so sánh khả năng tăng trưởng của chúng.
Các bước thực hiện :
Lấy một lượng sinh khối các chủng nấm men tương đối đều nhau (một vịng que cấy) hoạt hĩa trong ống nghiệm chứa 5ml mơi trường Hansen lỏng. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ.
Sau đĩ tiến hành đếm mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu. Nếu mật độ tế bào ban đầu của các chủng nấm men khơng bằng nhau thì chỉnh lại bằng cách pha lỗng với mơi trường Hansen lỏng. Sau đĩ kiểm tra lại mật độ tế bào sống bằng cách đếm khuẩn lạc.
2.2.2. Khảo sát tỉ lệ phối hợp giữa khối lượng BC với thể tích mơi trường (MT) rỉ đường thích hợp cho sự tăng trưởng của các chủng nấm men
Mục đích :
- Khảo sát độ ẩm của giá đỡ phù hợp cho sự tăng trưởng của nấm men.
Các bước thực hiện:
- BC sau khi lấy ra khỏi mơi trường lên men được ngâm và thay nước liên tục trong 3 ngày (4 giờ một lần).
- Cân để xác định khối lượng của các miếng BC.
- Sấy miếng BC đến cịn 50% khối lượng.
- Thu các miếng BC cĩ khối lượng khoảng 80g (cĩ bề dày phù hợp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo).
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 41
- Chuẩn bị mơi trường rỉ đường [MT2] cĩ nồng độ 2X.
- Tùy vào từng tỷ lệ kết hợp, ta sẽ bổ sung mơi trường rỉ đường nồng độ 2X với các thể tích khác nhau (được biểu diễn trong bảng 3) để sau khi kết hợp với BC thì tất cả các mơi trường đều cĩ nồng độ 1X nhưng cĩ độ ẩm khác nhau.
Bảng 3.1: Tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC với thể tích MT rỉ đường
- Sau khi bổ sung mơi trường, cho miếng BC vào và đem hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
- BC sau hấp khử trùng vẫn được ngâm trong mơi trường khoảng 24 giờ để trương nở hồn tồn.
- Sau 24 giờ, đặt mỗi miếng BC đã trương nở vào hộp nhựa. - Cấy 10% giống nấm men đã điều chỉnh mật độ trong mơi trường Hansen lỏng lên bề mặt miếng BC chứa mơi trường rỉ đường.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Sau 3, 4, 5, 6, 7 ngày, tiến hành thu sinh khối trên BC đối với mỗi nghiệm thức, sấy khơ sinh khối đến khối lượng khơng đổi.
Đối chứng (trong mơi trường rỉ đường lỏng cĩ sục khí):
Các bước thực hiện
- Pha mơi trường rỉ đường [MT2] cĩ nồng độ 1X, phối vào các bình thủy tinh với các thể tích như các nghiệm thức ở bảng 4 và hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút.
Mơi trường rỉ đường Nghiệm thức Tỷ lệ phối hợp Khối lượng BC (g) V 2X (ml) V H2O(ml) Nồng độ sau 1 1:2 80 120 40 1X 2 1:2,5 80 140 60 1X 3 1:3 80 160 80 1X
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 42
Bảng 3.2: Thể tích MT rỉ đường sục khí
- Pha 1000ml nước muối NaCl 10% trong một bình thủy tinh dung tích 2000ml.
- Cấy 10% giống nấm men đã điều chỉnh mật độ trong mơi trường Hansen lỏng vào các bình chứa mơi trường rỉ đường.
Chỉ tiêu theo dõi
- Sau 3, 4, 5, 6, 7 ngày tiến hành thu dịch lỏng rồi ly tâm để thu sinh khối nấm men đối với mỗi nghiệm thức, sấy khơ sinh khối đến khối lượng khơng đổi.
2.3. Thử nghiệm khả năng tăng trưởng của các chủng nấm men trên BC tái sử dụng trên BC tái sử dụng trên BC tái sử dụng
Mục đích
- Một trong những ưu điểm của phương pháp nhân sinh khối nấm men trên giá đỡ BC là cĩ thể tái sử dụng lại BC sau khi đã thu sinh khối.
- Tận dụng lượng giống cịn sĩt lại, tận dụng nguồn dinh dưỡng sẵn cĩ, giảm lượng chất thải.
Các bước thực hiện
- Sau khi thu nhận sinh khối nấm men, bổ sung tiếp mơi trường rỉ đường với nồng độ và tỉ lệ như trên.
- Bổ sung thêm 2% giống nấm men đã điều chỉnh mật độ trong mơi trường Hansen lỏng lên bề mặt miếng BC chứa mơi trường rỉ đường.
Chỉ tiêu theo dõi
- Sau 3, 4, 5, 6, 7 ngày tiến hành thu sinh khối trên BC đối với mỗi nghiệm thức, sấy khơ sinh khối đến khối lượng khơng đổi.
Nghiệm
thức
Thể tích mơi trường rỉ
đường nồng độ 1X (ml)
1’ 240
2’ 280
3’ 320
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 43
2.4. Khảo sát khả năng tăng trưởng của các chủng Azotobacter
trên giá đỡ BC
2.4.1. Xác định mật độ tế bào ban đầu của các chủng Azotobacter
Mục đích :
- Điều chỉnh mật độ tế bào ban đầu của các chủng Azotobacter sao
cho tương đối bằng nhau để so sánh khả năng tăng trưởng của chúng.
Các bước thực hiện - Tương tự 2.2.1
- Tuy nhiên cĩ sự khác biệt : mơi trường nuơi cấy Azotobacter là
mơi trường Ashby.
2.4.2. Khảo sát tỉ lệ phối hợp giữa khối lượng BC với thể tích MT
Ashby thích hợp cho sự tăng trưởng của các chủng Azotobacter
Mục đích :
- Khảo sát độ ẩm của giá đỡ phù hợp cho sự tăng trưởng của
Azotobacter.
Các bước thực hiện - Tương tự 2.2.2
- Tuy nhiên cĩ sự khác biệt:
Mơi trường nuơi cấy Azotobacter là mơi trường Ashby.
Tỷ lệ kết hợp giữa khối lượng BC với thể tích mơi trường Ashby
Thể tích mơi trường Ashby sục khí (đối chứng).
Bảng 3.3: Tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC với thể tích MT Ashby Mơi trường Ashby
Nghiệm thức Tỷ lệ phối hợp Khối lượng BC (g) V 2X (ml) V H2O(ml) Nồng độ sau 1 1:1 80 80 0 1X 2 1:2 80 120 40 1X 3 1:2,5 80 140 60 1X 4 1:3 80 160 80 1X
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 44 Bảng 3.4: Thể tích MT Ashby sục khí Nghiệm thức Thể tích mơi trường Ashby nồng độ 1X (ml) 1’ 160 2’ 240 3’ 280 4’ 320
Chỉ tiêu theo dõi
- Sau 5, 6, 7, 8 ngày tiến hành thu sinh khối Azotobacter trên BC
đối với mỗi nghiệm thức, sấy khơ sinh khối đến khối lượng khơng đổi. Cịn mơi trường lỏng sục khí thì thu dịch lỏng rồi ly tâm để thu sinh khối
Azotobacter đối với mỗi nghiệm thức, sấy khơ sinh khối đến khối lượng khơng
đổi.
2.5. Thử nghiệm khả năng tăng trưởng của các chủng
Azotobacter trên BC tái sử dụng
Các bước thực hiện - Tương tự như mục 2.3
- Tuy nhiên cĩ sự khác biệt : mơi trường nuơi cấy Azotobacter là
mơi trường Ashby.
Chỉ tiêu theo dõi
- Sau 5, 6, 7, 8 ngày tiến hành thu sinh khối Azotobacter trên BC
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 45
1. Nhân giống A. xylinum để thu cellulose vi khuẩn (BC)
- Giống A. xylinum từ ống thạch nghiêng được hoạt hĩa trong 5ml mơi trường MT4 trong ống nghiệm. Sau 24 giờ A. xylinum tạo một lớp màng mỏng
tại bề mặt tiếp xúc giữa khơng khí và mơi trường lỏng.
- Trong nhân giống cấp 2 và 3 A. xylinum cũng tạo một lớp màng tương
tự như trong nhân giống cấp 1.
Hình 4.1: Hoạt hĩa A. xylinum sau 24 giờ
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 46
nhận miếng BC cĩ màu vàng, đục và dai.
Hình 4.3: Miếng BC sau 4 ngày lên men tĩnh, chưa xử lý
Xử lý BC tươi sau khi thu hoạch
Bảng 4.1: Xử lý miếng BC
STT Phương pháp xử lý BC Tính chất cảm quan 1 Đun với NaOH 3% (30 phút), trung
hịa lại bằng HCl 5%
Sau 3 ngày BC màu vàng chuyển sang màu trắng đục, khơng mùi.
2 Ngâm với NaOH 3% (12 giờ), trung hịa lại bằng HCl 5%
Sau 3 ngày BC màu vàng chuyển sang màu trắng trong, khơng mùi.
3 Ngâm nước (24 giờ, thay nước 4 lần), vắt lần 1 (độ ẩm sau khi vắt 50 – 55%). Ngâm nước cho trương nở trở lại (24 giờ, thay nước 4 lần). Lặp lại 2 lần
Sau 2 ngày BC màu vàng dần dần chuyển sang màu trắng trong, khơng mùi
4 Ngâm với NaOH 3% (2 giờ), trung hịa bằng HCl 5%. Lặp lại phương pháp 3
Sau 3 ngày BC màu vàng chuyển sang màu trắng trong, khơng mùi
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 47
và thích hợp cho các thí nghiệm sau này. Tuy nhiên chúng tơi chọn phương pháp 3 để xử lý BC vì đơn giản, ít tốn kém, thời gian xử lý ngắn và hiệu quả.
Hình 4.4: Miếng BC đã qua xử lý
2. Khảo sát khả năng tăng trưởng của các chủng nấm men trên giá đỡ BC
BC
2.1. Xác định mật độ tế bào ban đầu của các chủng nấm men - Bảng 4.2: Mật độ tế bào nấm men ban đầu và sau khi pha lỗng : Chủng Phương pháp đếm hồng cầu (x106tế bào/ml) Số lần pha lỗng
Sau khi pha lỗng (x106tế bào/ml) Phương pháp đếm khuẩn lạc (x106tế bào/ml) S. cerevisiae 55,25 2 lần 27,625 22,6625 Rhodotorula 27,45 1 lần 27,45 21,9125 Nhận xét:
- Khi đếm bằng buồng đếm hồng cầu thì mật độ tế bào ban đầu của các chủng nấm men khơng bằng nhau. Do vậy cần pha lỗng bằng dung dịch Hansen để điều chỉnh lại.
- Kết quả ghi nhận được bằng phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định mật độ tế bào sống ta nhận thấy mật độ tế bào sống của chúng tương đối bằng nhau.
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 48
trường (MT) rỉ đường thích hợp cho sự tăng trưởng của các chủng nấm men
2.2.1. Chủng Saccharomyces cerevisiae
- Nhân sinh khối nấm men S. cerevisiae trên BC với tỉ lệ phối hợp giữa
khối lượng BC với thể tích MT rỉ đường là 1:2, 1:2,5, 1:3. Tiến hành thu sinh khối ở ngày thứ 3, 4, 5, 6, 7 và kết quả thu đuợc như sau:
Hình 4.5: Sinh khối S.cerevisiae ở tỉ lệ 1:2 sau 5 ngày. Hình 4.6: Sinh khối S.cerevisiae ở tỉ lệ 1:2,5 sau 5 ngày. Hình 4.7: Sinh khối S.cerevisiae ở tỉ lệ 1:3 sau 5 ngày.
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 49
theo thời gian nuơi cấy.
Tỉ lệ phối hợp mBC : VMT rỉ đường Thời gian thu
nhận (ngày) 1:2 1:2,5 1:3 3 0.1058 0.2738 0.2060 4 0.2277 0.4614 0.3913 5 0.3612 0.5644 0.5122 6 0.3639 0.5648 0.5129 7 0.3660 0.5651 0.5133
Biểu đồ 4.1: Sinh khối S. cerevisiae khơ (g) thu được trên BC với
các tỉ lệ theo thời gian nuơi cấy
Nhận xét:
Dựa vào đồ thị 4.1, kết quả bảng 4.3 và phụ lục 19, ta cĩ nhận xét: - Ngày thứ 5 sinh khối thu được là tốt nhất (tỉ lệ 1:2 là 0,3612g; tỉ lệ 1:2,5 là 0,5644g; tỉ lệ 1:3 là 0,5122g), những ngày về sau lượng sinh khối cĩ tăng nhưng khơng đáng kể (sự khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống
kê). Vậy ngày thu sinh khối thích hợp đối với S. cerevisiae là ngày thứ 5.
- Tỉ lệ phối hợp giữa khối lượng BC với thể tích MT rỉ đường 1:2,5 là tốt nhất (lượng sinh khối khơ của tỉ lệ 1:2,5 là 0,5644g).
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 50 cerevisiae với các tỉ lệ như trên. Tiến hành thu sinh khối ở ngày thứ 3, 4, 5, 6,
7 và kết quả thu đuợc như sau:
Hình 4.8: Hệ thống nhân sinh khối nấm men trong MT rỉ đường sục khí.
Bảng 4.4: Sinh khối S. cerevisiae khơ (g) thu được trong MT rỉ đường
sục khí với các tỉ lệ theo thời gian nuơi cấy.
Tỉ lệ Thời gian thu
nhận (ngày) 1:2 1:2,5 1:3 3 0.2272 0.3046 0.2861 4 0.2867 0.3979 0.3361 5 0.2871 0.3984 0.3367 6 0.2882 0.3993 0.3374 7 0.2885 0.3996 0.3386
SVTH: Lê Thanh Quỳnh Trang 51
Biểu đồ 4.2: Sinh khối S. cerevisiae khơ (g) thu được trong MT rỉ
đường sục khí với các tỉ lệ theo thời gian nuơi cấy
Biểu đồ 4.3: Sinh khối S. cerevisiae khơ (g) giữa trên BC và trong
MT rỉ đường sục khí
Nhận xét:
Dựa vào biểu đồ 4.2, kết quả bảng 4.4 và phụ lục 21, ta cĩ nhận xét: - Thời gian thu sinh khối thích hợp nhất là ngày thứ 4 (tỉ lệ 1:2 là 0,2867g; 1:2,5 là 0,3979g; 1:3 là 0,3361g), những ngày về sau lượng sinh khối cĩ tăng nhưng khơng đáng kể (sự khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống
