3. đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, NỘI DUNG
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu nấm mốc
3.4.3.1. Tiến hành phân lập
Lấy 10 g mẫu quả cam thối hỏng cho vào bình tam giác 250 ml ựã có sẵn 90 ml nước vô trùng ựặt lên máy lắc trong vòng 20 phút. Dùng một loạt ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước vô trùng có pha thêm 0,1% thạch ựể pha loãng (bằng cách này ta sẽ rửa hết ựược bào tử ựắnh ở trên mẫu và do dịch pha có tắnh chất keo nên bào tử phân tán ựược ựều ựặn hơn). Dịch mẫu ựược pha loãng bậc 10 thành dãy pha loãng. Mỗi ựộ pha loãng ựược cấy gạt vào ắt nhất 3 hộp peptri chứa một trong ba môi trường trên và nuôi cấy ở 30 - 350C, trong 3 - 5 ngày. Sau khi nấm mốc ựã mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ, tách thuần khiết riêng từng loại và cấy sang ống thạch nghiêng ựể tiếp tục những nghiên cứu khác.
để phân loại thuần chủng, chúng tôi dùng que cấy vô trùng cấy vào ống nước vô trùng, chấm từng loại khuẩn lạc ựã mọc tốt trong ựĩa peptri (phân biệt bằng quan sát ựại thể) sao cho không bị lẫn các loại bào tử khác nhau (của những khuẩn lạc khác loại), sau ựó cấy ba chấm vào các ống thạch nghiêng chứa các môi trường trên. Tiếp tục nuôi trong tủ ấm 3 - 5 ngày sẽ thu ựược các ống nghiệm mà mỗi ống chỉ chứa một loại khuẩn lạc nhất ựịnh. Giữ các ống trong tủ lạnh 40C ựể phân loại dần.
3.4.3.2. Phân loại nấm mốc chắnh
Chuẩn bị môi trường thạch ựĩa PDA: Pha môi trường nói trên vào các bình tam giác. Khử trùng bằng autoclave ở nhiệt ựộ 1210C, thời gian 30 phút. Làm nguội tới 40-450C, phân vào các ựĩa peptri vô trùng và sấy khô mặt thạch.
Khi phân loại dùng que cấy vô trùng lấy nấm từ những ống nghiệm ựã ựược phân lập thuần chủng ra ựĩa peptri. Khi cấy xong, úp ựĩa ựể các bào tử không rơi ra môi trường xung quanh. Nuôi ở nhiệt ựộ và ựộ ẩm thắch hợp (30
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
- 350C, ựộ ẩm 80 - 85%), sau 3 - 5 ngày quan sát ựại thể và xem khuẩn lạc ở vật kắnh nhỏ ựể thấy những ựặc ựiểm hình thái chung.
Khi quan sát phần ựại thể chú ý những ựặc ựiểm sau: - Tốc ựộ phát triển, ựường kắnh của khuẩn lạc.
- Màu sắc và sự thay ựổi màu sắc của khuẩn lạc
- Hình thái mặt trái của khuẩn lạc (màu sắc, hình dạng các nếp nhăn). - Màu sắc của môi trường (sắc tố khuếch tán hay không khuếch tán). - Hình thái khuẩn ty (thưa, dày, mịn, xốp, ựồng ựều hay không). - Sự tạo thành các giọt nước ựọng trên bề mặt khuẩn lạc.
Tùy loài phát triển nhanh chậm mà 7 - 10 ngày hoặc 15 ngày sau quan sát lại làm tiêu bản vi thể xem chi tiết các cơ quan sinh sản: cuống sinh bào tử, bào tử ựắnh, kết cấu hình thái bào tử.
3.4.3.3. Pha dung dịch chủng cấy giống
Hai chủng P. digitatum và P. italicum phân lập từ phần thối hỏng của quả cam ựược dùng ựể nghiên cứu. Chủng phân lập ựược nhân trong môi
trường PDA (Potato Dextrose Agar)ở 250C trong 7 ngày. Bào tử ựược thu về
bằng cách tráng nước tinh khiết bề mặt ựĩa cấy. Dung dịch ựược cho thêm Tween 80 (0,05% khối lượng trên thể tắch) ựể tạo nhũ tương. Dịch nuôi cấy dùng nghiên cứu có nồng ựộ 105-106 bào tử trên ml. Nồng ựộ này ựược xác ựịnh bằng máy ựếm bào tử.
3.4.3.4. Cấy chủng giống trên quả
- đục lỗ trên quả cam: Dùng dụng cụ ựục lỗ có ựường kắnh 4mm ựục 6 lỗ xung quanh cuống quả. Không ựục lỗ sâu quá vào trong dịch quả và không nông quá vào tuyến tinh dầu trên vỏ.
- Cấy chủng: Tất cả các thao tác liên quan ựến vi sinh vật ựều ựược tiến hành trong tủ cấy vô trùng bên cạnh ngọn lửa ựèn cồn, với các thiết bị và dụng cụ vô trùng ựể tránh nhiễm khuẩn. Hai chủng ựược cấy ựộc lập.
đổ dung dịch giống cấy ựã ựược chuẩn bị ra cốc thủy tinh, dùng công tơ hút lấy dịch nhỏ lần lượt 1 giọt (khoảng 25 ộm) vào các lỗ ựã ựục trên quả.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
Những quả sau khi cấy chủng ựược ựể khô tránh chảy dịch rồi xếp vào các lô. Sau 48 giờ (nhiệt ựộ 20 - 250C, ựộ ẩm 80 - 85%) các lô trên ựựơc xử lý. Các công thức xử lý với nước nóng ựược nhúng trong bể ổn nhiệt.