3. đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, NỘI DUNG
3.1. đối tượng, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. đối tượng
Quả cam Hàm Yên ựược thu mua tại vườn rồi chở về phòng thắ nghiệm trong vòng một ngày. Chọn những quả có hình thức ựẹp, tương ựối ựồng ựều, không bị tổn thương cơ học và nấm bệnh, không bị mềm.
3.1.2. địa ựiểm
Thắ nghiệm ựược tiến hành tại các phòng thắ nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất lượng nông sản thực phẩm thuộc Viện cơ ựiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.
3 3..11..33..TThhờờiiggiiaann V Vụụqquuảả22001111--22001122 3.2. Thiết bị và hóa chất 3.2.1. Thiết bị
- Thiết bị xử lý nước nóng là bể ổn nhiệt Ref. Bath-JSRC-13C; có thể ựặt nhiệt ựộ chắnh xác ựến ơ ựộ C (loại V=10L và 30L);
- đồng hồ bấm giây;
- Thiết bị phân tắch chất lượng, gồm:
+ Máy ựo màu cầm tay Color Meter (Tec PCM/PSM, Mỹ) + Máy ựo hô hấp (ICA, Anh)
+ Chiết quang kế ựiện tử pocket PAL - α . 3840 của Nhật + Cân phân tắch
+ Máy ựo ựộ cứng quả Penetrometer fruit pressure tester. Mod. FT 327 của Cộng Hòa Liên Bang đức.
- Thiết bị xác ựịnh vi sinh vật, gồm: Tủ sấy, tủ cấy vi sinh vật; Kắnh hiển vi; đèn chiếu tia cực tắm; Hộp peptri; cốc thủy tinh, ựũa thủy tinh; Dụng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
3.2.2. Hóa chất
- Các muối natri cacbonat, natri bicacbonate và amoni bicacbonate của Trung Quốc;
- Tween 80; nước cất;
- Cồn ethanol 96% của Việt Nam; - Các hóa chất phân tắch chất lượng;
3.2.3. Các môi trường
Ba môi trường ựược sử dụng là những môi trường ựiển hình trong nghiên cứu nấm mốc.
Môi trường Czapek - Dox (g/l):
Sacaroza 30 MgSO4.7H2O 0,5 NaNO3 2
FeSO4 0,01 K2HPO4 1 Thạch 20 KCl 0,5 Nước cất 11 pH = 6,5 - 6,8
Môi trường Pepton - glucoza (g/l):
Glucoza 10 MgSO4.7H2O 0,5 Pepton 5 Thạch 20 KH2PO4 1 Nước cất 11 pH = 5,6 - 6
Môi trường Sauboraud - glucoza (g/l):
Mantoz 10 Pepton 10 Thạch 2 Nước cất 11 pH = 5,6
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1. Phân lập chủng nấm mốc xanh P. digitatum và P. italicum từ
quả cam Hàm Yên.
3.3.2. Nội dung 2. Xác lập chế ựộ xử lý nước nóng thắch hợp nhằm kiểm soát
tối ựa sự phát triển của nâm mốc xanh P. digitatum và P. italicum trên quả cam Hàm Yên.
3.3.3. Nội dung 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nước nóng kết hợp với
muối cacbonate và bicacbonate tới khả năng kiểm soát nấm mốc xanh P. digitatum và P. italicum trên quả cam Hàm Yên.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
3.3.4. Nội dung 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hoạt ựộng bề mặt (Tween
80) tới hiệu quả kiểm soát nấm mốc xanh trên quả cam Hàm Yên khi xử lý bằng nước nóng kết hợp với muối cacbonate và bicacbonate.
3.3.5. Nội dung 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nước nóng kết hợp với
ethanol tới khả năng kiểm soát nấm mốc xanh P. digitatum và P. italicum trên quả cam Hàm Yên.
3.3.6. Nội dung 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nước nóng và xử lý kết
hợp với hóa chất và chất hoạt ựộng bề mặt tới sự thay ựổi chất lượng quả cam
trong quá trình bảo quản.
3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu 3.4.1. Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu
Tại phòng thắ nghiệm, cam ựược lựa chọn những quả ựồng ựều về ựộ chắn và kắch thước (khối lượng trung bình 240-250g/quả), loại bỏ những quả dập nát, thối hỏng và sâu bệnh, cắt cuống sát núm quả. Sau ựó cam ựược rửa sạch bằng nước máy, ựể khô ở nhiệt ựộ phòng.
3.4.2. Bố trắ thắ nghiệm
3.4.2.1. Thắ nghiệm 1: Xác ựịnh nhiệt ựộ xử lý thắch hợp ựể kiểm soát nấm
mốc xanh P. digitatum và P. italicum trên quả cam bằng xử lý nước nóng ở
các nhiệt ựộ khác nhau trong thời gian cố ựịnh (180s).
Mục ựắch của phương pháp là xác ựịnh nhiệt ựộ tối ưu khi xử lý nước
nóng ựể kiểm soát nấm mốc xanh P. digitatum và P. italicum. Quả cam ựược
tiệt trùng bằng lau cồn 700. Xử lý 3 quả cho mỗi công thức thắ nghiệm (18 giếng cấy). Sau ựó cấy 25-30 micro lắt dịch bào tử nấm mốc xanh vào từng giếng. để khô tự nhiên 48 giờ trong phòng vô trùng trước khi xử lý nước nóng. Các thắ nghiệm ựược xử lý theo các công thức sau:
(1) CT1: Xử lý nước nóng ở 480C (2) CT2: Xử lý nước nóng ở 500C (3) CT3: Xử lý nước nóng ở 520C (4) CT4: Xử lý nước nóng ở 540C
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
(5) CT5: Xử lý nước nóng ở 560C
(6) đC: Xử lý nước cất ở nhiệt ựộ phòng (200C)
Mỗi công thức lặp lại 3 lần, lô sau khi xử lý ựược ựể ráo nước rồi cất giữ ở nhiệt ựộ phòng trong túi chất dẻo màu ựen có ựục lỗ thoáng, ựộ ẩm 80 - 85%. Theo dõi và kiểm tra sự phát triển của nấm mốc trong các giếng cấy. Kết thúc thắ nghiệm khi tất cả các giếng của công thức ựối chứng ựều có nấm mọc. đếm số lỗ có nấm mọc ở tất cả các công thức. Tắnh tỷ lệ phần trăm số giếng có nấm mọc trên tổng số giếng cấy.
3.4.2.2. Thắ nghiệm 2. Xác ựịnh thời gian xử lý thắch hợp ựể kiểm soát nấm
mốc xanh P. digitatum và P. italicum trên quả cam bằng xử lý nước nóng ở
nhiệt ựộ ựã xác ựịnh từ thắ nghiệm 1.
Mục ựắch của thắ nghiệm này là xác ựịnh thời gian thắch hợp khi xử lý nước nóng ở nhiệt ựộ ựã xác ựịnh trong thắ nghiệm 1 ựể kiểm soát nấm mốc xanh P. Digitatum và P. italicum. Cách chuẩn bị mẫu hoàn toàn tương tự như trong thắ nghiệm 1. Các công thức xử lý như sau:
(1) CT1: Xử lý nước nóng trong thời gian 60s (2) CT2: Xử lý nước nóng trong thời gian 120s (3) CT3: Xử lý nước nóng trong thời gian 180s (4) CT4: Xử lý nước nóng trong thời gian 240s (5) CT5: Xử lý nước nóng trong thời gian 300s
(6) đC: Xử lý trong thời gian 20s bằng nước cất ở nhiệt ựộ phòng.
3.4.2.3. Thắ nghiệm 3: So sánh hiệu quả trừ nấm của các muối cacbonate và bicacbonate kết hợp với nhiệt ựộ nhằm kiểm soát tối ựa sự phát triển của nấm mốc xanh P. digitatum và P. italicum trên quả cam Hàm Yên.
Mục ựắch: Sử dụng các muối natri cacbonate, natri bicacbonate và amoni bicacbonate có cùng nồng ựộ (2%) ở các nhiệt ựộ khác nhau ựể so sánh và chọn ra muối có hiệu lực cao nhất. Các dung dịch Na2CO3, NaHCO3 và NH4HCO3 nồng ựộ 2% ựược pha từ dạng bột tinh khiết. Các công thức ựược xử lý như sau:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
(2) CT2: Dung dịch Na2CO3 2%, nhiệt ựộ 450C; (3) CT3: Dung dịch NaHCO3 2%, nhiệt ựộ 350C; (4) CT4: Dung dịch NaHCO3 2%, nhiệt ựộ 450C; (5) CT5: Dung dịch NH4HCO3 2%, nhiệt ựộ 350C; (6) CT6: Dung dịch NH4HCO3 2%, nhiệt ựộ 450C; (7) đC: Xử lý bằng nước cất ở nhiệt ựộ phòng.
3.4.2.4. Thắ nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hoạt ựộng bề mặt (Tween 80) tới hiệu quả kiểm soát nấm mốc xanh trên quả cam Hàm Yên khi xử lý bằng nước nóng kết hợp với các muối cacbonate và bicacbonate. Các công thức thắ nghiệm ựược xử lý trong thời gian cố ựịnh ựược xác ựịnh từ thắ nghiệm 2, cụ thể như sau:
(1) CT1: Na2CO3 2% + Tween 0,1%, nhiệt ựộ 450C
(2) CT2: NaHCO3 2% + Tween 0,1%, nhiệt ựộ 450C
(3) CT3: NH4HCO3 2% + Tween 0,1%, nhiệt ựộ 450C
3.4.2.5. Thắ nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nước nóng kết hợp với ethanol tới khả năng kiểm soát nấm mốc xanh P. digitatum và P. italicum
trên quả cam Hàm Yên. Các công thức thắ nghiệm ựược xử lý trong thời gian cố ựịnh ựược xác ựịnh từ thắ nghiệm 2, cụ thể như sau:
(1) CT1: Ethanol 10%; Nhiệt ựộ 350C (2) CT2: Ethanol 10%; Nhiệt ựộ 450C (3) CT3: Ethanol 15%; Nhiệt ựộ 350C (4) CT4: Ethanol 15%; Nhiệt ựộ 450C (5) CT5: Ethanol 20%; Nhiệt ựộ 350C (6) CT6: Ethanol 20%; Nhiệt ựộ 450C (7) CT7: Ethanol 30%; Nhiệt ựộ 350C (8) CT8: Ethanol 30%; Nhiệt ựộ 450C (9) đC: Ethanol 0%; Nhiệt ựộ 200C
3.4.2.6. Thắ nghiệm 6: đánh giá ảnh hưởng của xử lý nước nóng và xử lý kết
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
trong quá trình bảo quản. Các công thức ựược bố trắ, gồm: đối chứng: quả không xử lý
CT1: Kết quả tốt nhất thu ựược từ thắ nghiệm 1 và thắ nghiệm 2 CT2: Kết quả tốt nhất thu ựược từ thắ nghiệm 4
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu nấm mốc
3.4.3.1. Tiến hành phân lập
Lấy 10 g mẫu quả cam thối hỏng cho vào bình tam giác 250 ml ựã có sẵn 90 ml nước vô trùng ựặt lên máy lắc trong vòng 20 phút. Dùng một loạt ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước vô trùng có pha thêm 0,1% thạch ựể pha loãng (bằng cách này ta sẽ rửa hết ựược bào tử ựắnh ở trên mẫu và do dịch pha có tắnh chất keo nên bào tử phân tán ựược ựều ựặn hơn). Dịch mẫu ựược pha loãng bậc 10 thành dãy pha loãng. Mỗi ựộ pha loãng ựược cấy gạt vào ắt nhất 3 hộp peptri chứa một trong ba môi trường trên và nuôi cấy ở 30 - 350C, trong 3 - 5 ngày. Sau khi nấm mốc ựã mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ, tách thuần khiết riêng từng loại và cấy sang ống thạch nghiêng ựể tiếp tục những nghiên cứu khác.
để phân loại thuần chủng, chúng tôi dùng que cấy vô trùng cấy vào ống nước vô trùng, chấm từng loại khuẩn lạc ựã mọc tốt trong ựĩa peptri (phân biệt bằng quan sát ựại thể) sao cho không bị lẫn các loại bào tử khác nhau (của những khuẩn lạc khác loại), sau ựó cấy ba chấm vào các ống thạch nghiêng chứa các môi trường trên. Tiếp tục nuôi trong tủ ấm 3 - 5 ngày sẽ thu ựược các ống nghiệm mà mỗi ống chỉ chứa một loại khuẩn lạc nhất ựịnh. Giữ các ống trong tủ lạnh 40C ựể phân loại dần.
3.4.3.2. Phân loại nấm mốc chắnh
Chuẩn bị môi trường thạch ựĩa PDA: Pha môi trường nói trên vào các bình tam giác. Khử trùng bằng autoclave ở nhiệt ựộ 1210C, thời gian 30 phút. Làm nguội tới 40-450C, phân vào các ựĩa peptri vô trùng và sấy khô mặt thạch.
Khi phân loại dùng que cấy vô trùng lấy nấm từ những ống nghiệm ựã ựược phân lập thuần chủng ra ựĩa peptri. Khi cấy xong, úp ựĩa ựể các bào tử không rơi ra môi trường xung quanh. Nuôi ở nhiệt ựộ và ựộ ẩm thắch hợp (30
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
- 350C, ựộ ẩm 80 - 85%), sau 3 - 5 ngày quan sát ựại thể và xem khuẩn lạc ở vật kắnh nhỏ ựể thấy những ựặc ựiểm hình thái chung.
Khi quan sát phần ựại thể chú ý những ựặc ựiểm sau: - Tốc ựộ phát triển, ựường kắnh của khuẩn lạc.
- Màu sắc và sự thay ựổi màu sắc của khuẩn lạc
- Hình thái mặt trái của khuẩn lạc (màu sắc, hình dạng các nếp nhăn). - Màu sắc của môi trường (sắc tố khuếch tán hay không khuếch tán). - Hình thái khuẩn ty (thưa, dày, mịn, xốp, ựồng ựều hay không). - Sự tạo thành các giọt nước ựọng trên bề mặt khuẩn lạc.
Tùy loài phát triển nhanh chậm mà 7 - 10 ngày hoặc 15 ngày sau quan sát lại làm tiêu bản vi thể xem chi tiết các cơ quan sinh sản: cuống sinh bào tử, bào tử ựắnh, kết cấu hình thái bào tử.
3.4.3.3. Pha dung dịch chủng cấy giống
Hai chủng P. digitatum và P. italicum phân lập từ phần thối hỏng của quả cam ựược dùng ựể nghiên cứu. Chủng phân lập ựược nhân trong môi
trường PDA (Potato Dextrose Agar)ở 250C trong 7 ngày. Bào tử ựược thu về
bằng cách tráng nước tinh khiết bề mặt ựĩa cấy. Dung dịch ựược cho thêm Tween 80 (0,05% khối lượng trên thể tắch) ựể tạo nhũ tương. Dịch nuôi cấy dùng nghiên cứu có nồng ựộ 105-106 bào tử trên ml. Nồng ựộ này ựược xác ựịnh bằng máy ựếm bào tử.
3.4.3.4. Cấy chủng giống trên quả
- đục lỗ trên quả cam: Dùng dụng cụ ựục lỗ có ựường kắnh 4mm ựục 6 lỗ xung quanh cuống quả. Không ựục lỗ sâu quá vào trong dịch quả và không nông quá vào tuyến tinh dầu trên vỏ.
- Cấy chủng: Tất cả các thao tác liên quan ựến vi sinh vật ựều ựược tiến hành trong tủ cấy vô trùng bên cạnh ngọn lửa ựèn cồn, với các thiết bị và dụng cụ vô trùng ựể tránh nhiễm khuẩn. Hai chủng ựược cấy ựộc lập.
đổ dung dịch giống cấy ựã ựược chuẩn bị ra cốc thủy tinh, dùng công tơ hút lấy dịch nhỏ lần lượt 1 giọt (khoảng 25 ộm) vào các lỗ ựã ựục trên quả.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
Những quả sau khi cấy chủng ựược ựể khô tránh chảy dịch rồi xếp vào các lô. Sau 48 giờ (nhiệt ựộ 20 - 250C, ựộ ẩm 80 - 85%) các lô trên ựựơc xử lý. Các công thức xử lý với nước nóng ựược nhúng trong bể ổn nhiệt.
3.4.4. Phương pháp xác ựịnh các chỉ tiêu chất lượng
3.4.4.1. Phương pháp ựánh giá chất lượng cảm quan
Các chỉ tiêu ựánh giá chât lượng cảm quan gồm: màu sắc vỏ quả, mùi, vị, trạng thái. đánh giá cảm quan ựược tiến hành theo phương pháp cho ựiểm. Sử dụng các giác quan ựể ựánh giá các chỉ tiêu về hình thức quả, vị, hương thơm, ựộ giòn của tép. Tất cả các chỉ tiêu ựều ựược ựánh giá theo thang ựiểm 5 (0-5 ựiểm). đánh giá cảm quan ựược tiến hành như sau: chuẩn bị phiếu trả lời, chuẩn bị mẫu, mã hóa mẫu, mời ựánh giá, tổng hợp kết quả. Có ba mẫu ựánh giá là CT1, CT2, đC và ựược mã hóa tương ứng là A, B, C. Tiến hành cảm quan gồm 5 thành viên, mỗi thành viên ựược phát một phiếu ựánh giá cảm quan và các mẫu cam ựã ựược mã hóa, thứ tự các mẫu khi phát cho các thành viên của hội ựồng là không giống nhau. Sau mỗi lần thử, các thành viên phải sử dụng nước lọc ựể thanh vị trước khi thử mẫu tiếp theo.
3.4.4.2. Phương pháp xác ựịnh hàm lượng chất rắn hòa tan
đối với cam, ựường là chất rắn chắnh hòa tan trong dịch quả và vì thế, hàm lượng chất rắn hòa tan có thể sử dụng ựể ựánh giá ựộ ngọt. Máy ựo chiết quang kế cầm tay pocket PAL - α . 3840 của Nhật ựược sử dụng ựể xác ựịnh % TSS (chất rắn hòa tan, tương ựương với ựộ Brix cho dung dịch ựường) trong một mẫu nhỏ dịch quả. Nhiệt ựộ sẽ ảnh hưởng ựến kết quả ựo (tăng khoảng 0,5% TSS khi tăng 5oC) nên cần ựiều chỉnh phép ựo ở nhiệt ựộ thường. để có kết quả chắnh xác hơn cần làm sạch và chuẩn hóa máy ựo giữa mỗi lần ựọc kết quả bằng nước cất (nên ựể 0% TSS ở 20oC).
3.4.4.3. Phương pháp ựo ựộ cứng quả
độ cứng quả ựược xác ựịnh bằng máy ựo ựộ cứng cầm tay Penetrometer Fruit Pressure Tester Mod. FT 327 của Cộng Hòa Liên Bang
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
đức. Dựa trên nguyên lý ựo ựộ lún (chiều sâu của ựầu kim vào thịt quả) dưới một lực tác dụng bằng nhau (quả cân 200g), trong cùng một ựơn vị thời gian.
độ cứng ựược tắnh theo công thức sau: X = F/S Trong ựó: X: là ựộ cứng của quả cam (kg/cm2)
F: Số chỉ của máy ựo
S: Diện tắch của mũi kim (cm2)
3.4.4.4. Phương pháp xác ựịnh hao hụt khối lượng tự nhiên
Hao hụt khối lượng tự nhiên ựược xác ựịnh bằng cách cân khối lượng từng quả ở mỗi công thức trước khi bảo quản và sau mỗi lần theo dõi. Công thức tắnh như sau: % 100 * ) ( % A B A X = −
X: Tỷ lệ hao hụt khối lượng tự nhiên (%); A: Khối lượng quả trước khi bảo quản (g); B: Khối lượng quả ở mỗi lần theo dõi (g).
3.4.4.5. Xác ựịnh tỷ lệ thối hỏng
Tỷ lệ thối hỏng ựược biểu thị bằng ựại lượng phần trăm hao hụt về số quả trong tổng số quả theo dõi trong bảo quản. Quả ựược tắnh là bị thối hỏng khắ xuất hiện các dấu hiệu ựặc trưng thối hỏng do nấm bệnh gây ra trên bề