Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.6.Phương pháp sản xuất kháng nguyên virus tinh chế
Tinh chế kháng nguyên ñược làm theo phương pháp Laver mô tả năm 1969. Sau khi thu dịch niệu xác ñịnh hiệu giá ngưng kết hồng cầu và li tâm bằng máy li tâm lạnh với tốc ñộ 5000v/ph trong 10 phút, loại bỏ cặn và thu dịch. Dịch này ñược xác ñịnh hiệu giá ngưng kết hồng cầu ñể kiểm tra lượng virus. Virus ñược cô ñặc bằng li tâm siêu tốc 30.000v/ph 40C trong 2 giờ với rotor góc cốñịnh T865 của máy li tâm Sorvall Pro80. Cặn virus ñược tinh chế
bằng li tâm phân vùng trong thang phân vùng saccaroza ở nồng ñộ 60, 30 và 15% pha trong ñệm PBS 0,01M, pH 7,0-7,2. Băng virus ñược hình thành sau khi li tâm tốc ñộ 25.000v/ph, 2 giờ, 40C với rotor góc văng Surespin 630 của máy li tâm Solvall Pro80. Thu nhận băng virus và thẩm tích 24 giờ trong ñệm PBS 0,01M.
Sau li tâm xuất hiện 2 băng, một băng nằm ở vùng có nồng ñộ ñường 15% (ký hiệu là F1 ), một băng nằm ở vùng có nồng ñộñường 30% (kí hiệu là F2). Hạt virus toàn phần tinh chếở băng F2 ñược thu nhận và tiến hành thẩm tích ñể loại bỏñường.
Băng virus ñược hút ra khỏi ống li tâm bằng bơm tiêm và chuyển sang túi thẩm tích. Túi thẩm tích ñược ñặt trong cốc ñựng PBS 0,01M, có khuấy từ
và tiến hành thẩm tích 24 giờ trong tủ lạnh 4oC.
Sau khi tinh chế, kháng nguyên ñược chuẩn ñộ bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu, bất hoạt virus bằng formaline 1/4000 trong tủ lạnh thường 4- 5oC, trong 5 ngày, ñiện di kiểm tra và ñịnh lượng protein HA bằng phương pháp khuếch tán miễn dịch trên thạch (SRD) sử dụng kháng nguyên HA và kháng huyết thanh chuẩn của NIBSC (Wood JM et al., 1977).
31