1.3. Cỳm gia cầm và cỏc ủặc ủiểm của virus cỳm gia cầm
1.3.2. Kháng nguyên của virus cúm gia cầm
Virus cỳm type A ủược xỏc ủịnh subtype dựa trờn cơ sở khỏng nguyờn (protein) bề mặt là HA (Hemagglutinin-viết tắt là H) và NA (Neuraminidase-viết tắt là N) cú vai trũ quan trọng trong miễn dịch bảo hộ. Hemagglutinin ủược coi là yếu tố vừa quyết ủịnh tớnh khỏng nguyờn, vừa quyết ủịnh ủộc lực của virus cúm A.
1.3.2.1. Protein HA (Hemagglutinin)
Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), khỏng thể ủặc hiệu với HA cú thể phong tỏa sự ngưng kết ủú, ủược gọi là khỏng
thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory antibody). Có 16 subtype HA ủó ủược phỏt hiện (H1 - H16), subtype H16 mới ủược tỡm thấy ở virus gõy bệnh cho hải õu ủầu ủen - Thụy ðiển, 1999), ba subtype (H1, H2 và H3) thớch ứng lõy nhiễm gõy bệnh ở người liờn quan ủến cỏc ủại dịch cỳm trong lịch sử (Murphy và Webster, 1996). Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus, có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện virus và khởi ủộng quỏ trỡnh xõm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender và cs, 1999;
Wagner và cs, 2002). Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 ủơn phõn (trimer), mỗi ủơn phõn (monomer) ủược tạo thành từ hai tiểu ủơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liờn kết với nhau bởi cỏc cầu nối disulfide (-S-S-). Cỏc ủơn phõn sau khi tổng hợp ủó ủược glycosyl húa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là tiểu ủơn vị HA2, phần ủầu tự do hỡnh chỏm cầu ủược tạo bởi dưới ủơn vị HA1 chứa ủựng vị trớ gắn với thụ thể thớch hợp của HA trờn bề mặt màng tế bào ủớch (Bosch và cs, 1981; Wagner và cs, 2002).
Hình 1.5. Mô phỏng cấu trúc kháng nguyên Haemalutinin và Neuraminidase (www.aht.org.uk)
Sự kết hợp của HA với thụ thể ủặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trờn bề mặt màng tế bào, khởi ủầu quỏ trỡnh xõm nhiễm của virus trờn vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
19
trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hỡnh khụng gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào ủớch với vị trớ gắn với thụ thể này trờn phõn tử HA của virus cỳm, quyết ủịnh sự xõm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau (Wagner và cs, 2002; Wasilenko và cs, 2008). Vị trớ axit amin 226 (aa226) của HA1 ủược xỏc ủịnh là vị trớ quyết ủịnh phự hợp gắn HA với thụ thể ủặc hiệu của nú, ở hầu hết cỏc chủng virus cỳm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở gúc quay α-2,3) của tế bào biểu mụ ủường hụ hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A). Ngoài ra, một số vị trí axit amin khác: Glutamine 222, Glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ ủến khả năng thớch ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ (Luong và Palese, 1993). ðặc biệt, một số chủng virus cường ủộc A/H5Nx;
A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải lượng cao trong ủường hụ hấp (do tiếp xỳc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm bệnh) (Bauer và cs, 2006; Hui, 2008; Wasilenko và cs, 2008).
Trình tự mã hóa chuỗi nối, và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như cỏc vị trớ axit amin liờn quan ủến khả năng gắn với thụ thể thớch ứng, ủược coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA (Luong và Palese, 1993). Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cỳm A, kớch thớch cơ thể sinh ra ủỏp ứng miễn dịch dịch thể ủặc hiệu với từng type HA, và tham gia vào phản ứng trung hũa virus, ủược coi là protein vừa quyết ủịnh tớnh khỏng nguyờn, vừa quyết ủịnh ủộc lực của virus, là ủớch của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở ủiều chế cỏc vacxin phũng cỳm hiện nay (Bosch và cs, 198; Horimoto và Kawaoka, 2001; Matrosovich và cs, 1999).
1.3.2.2. Protein NA (neuraminidase)
Protein neurominidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18), là một protein enzyme cú bản chất là glycoprotein ủược gắn trờn bề mặt capsid
của virus cỳm A, mang tớnh khỏng nguyờn ủặc trưng theo từng subtype NA (Baigent và Mc Cauley, 2001; Uiprasertkul và cs, 2007). Có 9 subtype (từ N1 ủến N9) ủược phỏt hiện chủ yếu ở virus cỳm gia cầm, hai subtype N1 và N2 ủược tỡm thấy ở virus cỳm người liờn quan ủến cỏc ủại dịch cỳm trong lịch sử (Wasilenko và cs, 2008). Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA trờn bề mặt capsid hạt virus. Phõn tử NA cú dạng nỳt lồi hỡnh nấm, ủầu tự do (chứa vựng hoạt ủộng) gồm 4 dưới ủơn vị giống như hỡnh cầu nằm trờn cựng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid (Castrucci và Kawaoka, 1993).
Protein NA cú vai trũ là một enzyme cắt ủứt liờn kết giữa gốc acid sialic của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, ủẩy nhanh sự lõy nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khỏc, NA tham gia vào phõn cắt liờn kết này trong giai ủoạn “hũa màng”, ủẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn (Uiprasertkul và cs, 2007). Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phúng neuraminic acid làm tan loóng màng nhầy bề mặt biểu mụ ủường hụ hấp, tạo ủiều kiện cho virus nhanh chúng tiếp cận tế bào biểu mụ và thoỏt khỏi cỏc chất ức chế khụng ủặc hiệu. Cựng với vai trũ của khỏng nguyờn HA, cả 3 khõu tỏc ủộng trờn của NA ủều tham gia làm gia tăng ủộc lực gõy bệnh của virus cỳm A ở cơ thể vật chủ. Do ủú, NA là ủớch tỏc ủộng của cỏc thuốc, húa dược ức chế virus khụng ủặc hiệu hiện nay, ủặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào ủớch, bảo vệ cơ thể (Aoki và cs, 2007; Castrucci và Kawaoka, 1993).
Bờn cạnh ủú, NA cũn là một khỏng nguyờn bề mặt của virus, tham gia kớch thớch hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra khỏng thể ủặc hiệu với khỏng nguyờn NA của cỏc chủng virus ủương nhiễm cú tỏc dụng phong tỏa protein NA (Doherty và cs, 2006). Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyờn HA của virus là cỏc ủớch chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
21
với virus cỳm A, và là cơ sở ủiều chế cỏc vacxin phũng cỳm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người (Suarez và Schultz-Cherry, 2000; Wu và cs, 2008).
1.3.2.3. Cỏc phương thức biến ủổi khỏng nguyờn
Cú ba phương thức chủ yếu làm biến ủổi khỏng nguyờn ở virus cỳm A (Wu và cs, 2008).
a. Hiện tượng lệch kháng nguyên
Lệch khỏng nguyờn (antigenic drift) thực chất là cỏc ủột biến ủiểm xảy ra cỏc phõn ủoạn gen/hệ gen của virus. Do virus cỳm A kớ sinh nội bào bắt buộc, khụng cú cơ chế “ủọc và sửa bản sao - proof reading” trong quỏ trỡnh phiờn mó và sao chộp ở nhõn tế bào ủớch. Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn ủến cỏc enzyme sao chộp phụ thuộc RNA sẽ cú thể “gài” thờm (ủột biến gión nở), làm mất ủi hoặc thay thế (ủột biến trượt-xúa) (Lờ Thanh Hũa và cs, 2006) một hay nhiều nucleotide mà khụng ủược sửa chữa trong phõn tử RNA chuỗi ủơn mới của virus (Conenello và cs, 2007; Murphy và Webster, 1996). Tuỳ thuộc vị trí xảy ra cỏc ủột biến trong bộ ba mó húa, mà cú thể trực tiếp làm thay ủổi cỏc axit amin trong trỡnh tự của protein ủược mó húa biểu hiện, dẫn ủến thay ủổi thuộc tớnh của protein, hoặc ủược tớch lũy trong phõn ủoạn gen xảy ra ủột biến (ủột biến ủiểm).
Tần suất xảy ra ủột biến ủiểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với ủộ dài của RNA hệ gen của virus cỳm A) thỡ cú 1 nucleotide sai khỏc (Prel và cs, 2008; Wagner và cs, 2002). Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới ủược sinh ra ủều chứa ủựng một ủột biến ủiểm trong hệ gen của nú, và cỏc ủột biến này ủược tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một subtype virus mới có những ủặc tớnh khỏng nguyờn mới cú thể bị sai lệch (Hỡnh 1.6).
Hiện tượng này thường xảy ra ở cỏc phõn ủoạn gen khỏng nguyờn NA và HA, tạo ra cỏc bộ mó tổng hợp cỏc axit amin mới, hoặc làm thay ủổi cấu trỳc dẫn ủến thay ủổi ủặc tớnh của protein ủú, hoặc cú khả năng glycosyl húa rất cao trong cấu trỳc chuỗi polypeptide khỏng nguyờn, tạo ra một biến thể virus mới thay ủổi ủộc lực gõy bệnh hay ủặc tớnh khỏng nguyờn mới (Wasilenko và cs, 2008, Macken và cs, 2006; Chen và cs, 2008).
b. Hiện tượng trộn kháng nguyên
Hiện tượng trộn khỏng nguyờn (cũn gọi là trao ủổi hay tỏi tổ hợp) cỏc gen kháng nguyên (antigenic shift) chỉ có ở virus cúm, và rất ít ở một số virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao. Hệ gen gồm 8 phõn ủoạn gen riờng biệt của virus cỳm A ủược 2 chủng virus cỳm A khỏc nhau khi ủồng nhiễm trong một tế bào trao ủổi cho nhau, ủể cú thể xảy ra sự hoà trộn (reassort) hoặc trao ủổi (swap) cỏc phõn ủoạn gen của hai chủng virus ủú trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen, tạo ra các trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của cỏc hạt virus mới từ hai RNA hệ gen của những virus ban ủầu. Kết quả là ủó tạo ra thế hệ virus mới cú cỏc phõn ủoạn gen kết hợp, và ủụi khi giỳp cho chỳng cú khả năng lõy nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng ủộc lực gõy bệnh (Hình 1.7) (Hilleman, 2002; Macken và cs, 2006; Chen và cs, 2006).
c. Hiện tượng glycosyl hóa
Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate (oligosaccharide) vào với axit amin Asparagine (N) ở một số vị trớ nhất ủịnh trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cỳm. Thụng thường chuỗi oligosaccharide ủược gắn tại vị trớ N-X-S/T (N = Asparagine; X = axit amin bất kì, trừ Proline; S/T = Serine hoặc Threonine) (Baigent và McCauley, 2001). ðõy là những vị trớ ủược cho là gắn kết với cỏc khỏng thể ủược cơ thể sinh ra do kớch thớch của khỏng nguyờn, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm. Hiện tượng lệch khỏng nguyờn sinh ra ủột biến ủiểm hỡnh thành bộ mó của Asparagine, tạo tiền ủề cho hiện tượng glycosyl húa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay ủổi biểu hiện ủặc tớnh khỏng nguyờn của HA và NA, giỳp cho virus thoỏt khỏi tỏc ủộng miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và ủiều hoà sự nhõn lờn của virus (Baigent và McCauley, 2001).
Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus cỳm A, khi ủồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả cỏc loài vật chủ khỏc nhau.
ðõy cũng chớnh là vấn ủề ủỏng lo ngại của virus cỳm A/H5N1 hiện nay, mặc dự virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gõy bệnh ủược cho người, và rất cú thể A/H5N1 tỏi tổ hợp (vay mượn) gen HA hay
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
23
NA, hoặc cả hai gen của cỏc chủng virus cỳm A ủó thớch nghi ở người, ủể tạo ra một biến chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một ủại dịch cỳm mới và ủặt ra một ủịnh hướng mới trong phũng chống (Hilleman, 2002; Guan và cs, 2002; Li và cs, 2004; Kim và cs, 2008).
ðỘT BIẾN ðIỂM Không có cơ chế ủọc-sửa bản sao
Quá trình sao chép nhân lên dưới xúc tác của RNA polymerase
Sao chép trong tế bào chủ
Dịch mã Protein ủột biến
Màng tế bào 8 phõn ủoạn gen TRỘN KHÁNG NGUYÊN
Chủng virus mới ủược tạo ra do hòa trộn các phõn ủoạn gen TẾ BÀO
Hỡnh 1.6. Sơ ủồ minh họa ủột biến ủiểm của cỏc phõn ủoạn genvirus cỳm A
Hỡnh 1.7. Sơ ủồ minh họa hiện tượng trộn kháng nguyên của virus cúm
A/H5N1và H3N2 (Lê Thanh Hòa và cs, 2006)