CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. Xỏc ủịnh ủặc tớnh di truyền của virus cỳm A/H5N1 thuộc clade 7 phõn lập ở Việt Nam (bằng phương pháp giải trình tự và lập cây phả hệ)
3.2.3. Giải trình tự gen M và phân tích cây phả hệ dựa trên chuỗi nucleotide của gen M
Hệ gen của virus cúm gia cầm type A nói chung và virus A/H5N1 gồm có 8 phõn ủoạn, trong ủú cú 2 phõn ủoạn gen HA và NA mó húa tạo nờn 2 loại khỏng nguyờn bề mặt cú ý nghĩa cho việc xỏc ủịnh subtype của virus. Tại thời ựiểm hiện tại các chủng virus cúm gia cầm ựộc lực cao A/H5N1 ở đông Nam Á có gen HA và NA có nguồn gốc và tiến hóa từ virus tiền thân là A/Goose/Guangdong/1/96 phỏt hiện ủược ở Trung Quốc. Trong khi ủú cỏc gen mã hóa cho các protein nội sinh (M, PA, PB2 và PB1) lại từ nhiều nguồn khác nhau. ðiều này ủó tạo nờn sự tỏi tổ hợp thành nhiều genotype khỏc biệt (Guan và cs, 2002; Li và cs, 2004). Vỡ vậy ủể nghiờn cứu thờm về ủặc tớnh di truyền của các chủng virus A/H5N1 thuộc clade 7 ở Việt Nam chúng tôi tiến hành giải trình tự gen M của các mẫu virus này.
Chiều dài chuỗi nucleotide của gen M ủó giải trỡnh tự là 983 bp (base pair) mó húa cho 2 ủoạn gen M1 và M2. Trỡnh tự của gen M của 5 chủng virus mà chỳng tụi phõn lập ủược mang so sỏnh với một số chủng virus cỳm gia cầm A/H5N1 ủộc lực cao phỏt hiện ở cỏc nước thuộc chõu Á, trong ủú cú chủng virus cỳm A/Goose/Guangdong/1/96 là virus thủy tổ của cỏc virus cỳm gia cầm ủộc lực cao và một số chủng virus ở Việt Nam trước ủõy. Dựa trờn sự sai khỏc chuỗi gen M của cỏc chủng virus A/H5N1 so sỏnh chỳng tụi ủó lập cõy phả hệ (phylogenetic tree) ủể theo dừi, phõn tớch sự tiến húa của cỏc chủng virus này so với các chủng virus cúm A/H5N1 trước kia.
Danh sỏch cỏc chủng virus A/H5N1 dựng ủể so sỏnh lập cõy phỏt sinh loài ủược trỡnh bày ở bảng 3.7.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
Hình 3.5. Cây phả hệ dựa trên chuỗ
A/H5N1 clade 7 (ðược lập bằng phương pháp phân tích neighbor-joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000)
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/2008 A/chicken/Shanxi/10/2006 2006
A/chicken/Shandong/A-10/2006 2006 A/chicken/Shanxi/2/2006 A/Beijing/01/2003
A/chicken/Korea/es/2003
A/black-headed goose/Qinghai/1/2005 A/chicken/Bhutan/248006/2010 A/duck/India/TR-NIV4396/2008 A/duck/Hunan/1386/2003
A/Indonesia/239H/2005 A/Indonesia/CDC1046/2007
A/Indonesia/535H/2006 A/Ck/Indonesia/2A/2003 2003
A/chicken/East Java/UT6045/2007 A/duck/Guangxi/351/2004 A/chicken/Thailand/ICRC-7356/2010
A/Thailand/Kan353/2004 2004 A/duck/Vietnam/48/2004 2004
A/Cambodia/P0322095/2005 A/Vietnam/CL100/2004 A/duck/Vietnam/286/2005
A/Muscovy duck/Ca Mau/07-04/2007 A/chicken/Lang Son/200/2005 2005
A/duck/Guiyang/3834/2005 2005 A/Anhui/T2/2006 2006 A/Anhui/2/2005 2005
A/Shanghai/1/2006 2006
A/crested myna/Hong Kong/540/2006 A/Hong Kong/6841/2010 A/mallard/Korea/1195/2010 A/Hunan/1/2006
A/duck/Guangxi/150/2006 A/duck/Laos/P0117/2007 A/duck/Zhejiang/52/2000
A/goose/Fujian/bb/2003
A/goose/Vietnam/3/05 2005
A/Duck/Hong Kong/y283/1997 A/Hong Kong/156/1997 A/duck/Shantou/195/2001
A/Chicken/Hong Kong/SF219/2001 A/Goose/Guangdong/1/96
99 100
99 99 99
94 93
96
67 52 94
91 94
77 83
83 83
80
77 74
68 68
66 59 55 58
97 46
33 41
33 35
33
25 31 53 14
27
28
34
53 51
0 .00 2
Clade 7
Clade 7
Bảng 3.7. Danh sỏch cỏc chủng virus cỳm A/H5N1 sử dụng ủể so sỏnh và lập cây phát sinh loài dựa trên gen M
STT Danh pháp quốc tế Loài
mắc
Năm phân lập
Nơi phân lập
Số ủăng ký ngân hàng gen 1 A/Goose/Guangdong/1/96 Ngỗng 1996 Trung Quốc AF144306 2 A/Hong Kong/156/1997 Người 1997 Hong Kong AF036358 3 A/Duck/Hong Kong/y283/1997 Vịt 1997 Hong Kong AF098567 4 A/duck/Zhejiang/52/2000 Vịt 2000 Trung Quốc AY585397 5 A/duck/Shantou/195/2001 Vịt 2001 Hong Kong CY029002 6 A/Chicken/Hong Kong/SF219/2001 Gà 2001 Trung Quốc AF509048, 7 A/chicken/Korea/es/2003 Gà 2003 Hàn Quốc EF541460 8 A/Ck/Indonesia/2A/2003 Gà 2003 Indonesia AY651377 9 A/goose/Fujian/bb/2003 Ngỗng 2003 Trung Quốc DQ997402 10 A/Beijing/01/2003 Người 2003 Trung Quốc EF587280 11 A/duck/Hunan/1386/2003 Vịt 2003 Trung Quốc CY029310 12 A/Thailand/Kan353/2004 2004 Người 2004 Thái Lan EF541446 13 A/duck/Guangxi/351/2004 Vịt 2004 Trung Quốc DQ320943 14 A/Vietnam/CL100/2004 Người 2004 Việt Nam DQ492986 15 A/duck/Vietnam/48/2004 2004 Vịt 2004 Việt Nam DQ492944 16 A/Cambodia/P0322095/2005 Người 2005 Cam pu
chia HQ200461
17 A/Indonesia/239H/2005 Người 2005 Indonesia EU146665 18 A/black-headed
goose/Qinghai/1/2005 Ngỗng 2005 Trung Quốc DQ100567
19 A/Anhui/2/2005 Người 2005 Trung Quốc CY060147
20 A/duck/Guiyang/3834/2005 Vịt 2005 Trung Quốc EF124151 21 A/chicken/Lang Son/200/2005 Gà 2005 Việt Nam GU186717 22 A/goose/Vietnam/3/05 2005 Ngỗng 2005 Việt Nam DQ366317 23 A/duck/Vietnam/286/2005 Vịt 2005 Việt Nam DQ492958 24 A/crested myna/Hong
Kong/540/2006 Chim 2006 Hong Kong EF12405
25 A/Indonesia/535H/2006 Người 2006 Indonesia EU146756 26 A/chicken/Shandong/A-10/2006 Gà 2006 Trung Quốc HM172139 27 A/chicken/shanxi/10/2006 Gà 2006 Trung Quốc HM172135.1 28 A/chicken/shanxi/2/2006 Gà 2006 Trung Quốc DQ914817
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
81
STT Danh pháp quốc tế Loài
mắc
Năm phân lập
Nơi phân lập
Số ủăng ký ngân hàng gen 29 A/Anhui/T2/2006 2006 Người 2006 Trung Quốc EU008577
30 A/Hunan/1/2006 Người 2006 Trung Quốc CY060173
31 A/Shanghai/1/2006 Người 2006 Trung Quốc AB462298 32 A/duck/Guangxi/150/2006 Vịt 2006 Trung Quốc EF124078 33 A/chicken/East Java/UT6045/2007 Gà 2007 Indonesia GQ122542 34 A/Indonesia/CDC1046/2007 Người 2007 Indonesia CY019411
35 A/duck/Laos/P0117/2007 Vịt 2007 Lào CY040921
36 A/Muscovy duck/Ca Mau/07-
04/2007 Ngan 2007 Việt Nam GU186746
37 A/duck/India/Tr-NIV4396/2008 Vịt 2008 Ấn ðộ CY046105 38 A/chicken/Bhutan/248006/2010 Gà 2010 Bhutan CY066007 39 A/mallard/Korea/1195/2010 Vịt
trời 2010 Hàn Quốc HQ695916 40 A/Hong Kong/6841/2010 Người 2010 Hong Kong HQ636463 41 A/chicken/Thailand/ICRC-
7356/2010 Gà 2010 Thái Lan HM590792
Dựa trên phân tích cây phả hệ của gen M chúng tôi có thể nhận xét rằng cỏc chủng virus cỳm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 7 của Việt Nam cú ủộ tương ủồng cao và xắp xếp thành một nhúm với nhau, và nằm trong nhúm với cỏc chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 của Trung Quốc. Kết quả phân tích này chứng tỏ gen M của các virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam và Trung Quốc có cựng nguồn gốc. ðể thấy rừ hơn sự khỏc biệt di truyền ở mức ủộ nucleotide và axit amin, chúng tôi so sánh gen M của các chủng virus cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam với một số virus cỳm A/H5N1của Trung Quốc. Kết quả ủược biểu thị ở bảng 3.8.
Mức ủộ sai khỏc về di truyền gen M giữa cỏc chủng virus cỳm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam với nhau gần như khụng ủỏng kể, cụ thể sự sai khỏc tối ủa về mức ủộ nucleotide là 1% và mức ủộ axit amin là 0,6%.
Mức ủộ sai khỏc giữa cỏc chủng virus cỳm A/H5N1thuộc clade 7 của Việt Nam và các chủng thuộc clade 7 của Trung Quốc cũng rất thấp. Sự sai khác tối
ủa về di truyền ở mức ủộ nucleotide và axit amin giữa cỏc virus của 2 nhúm này lần lượt là 3,0±0.1% và 3,3±0.2% (virus A/chicken/Shanxi/2/2006).
So sánh sự sai khác về di truyền giữa các chủng virus cúm thuộc clade 7 do chúng tôi phân lập với các chủng virus thuộc clade khác trên cơ sở gen M, chúng tôi nhận thấy sự sai khác về nucleotide và axit amin không nhiều, chỉ trong khoảng 3,6% về nucleotide và 2-4% về axit amin. Duy chỉ có 2 chủng A/goose/Vietnam/3/05 và chủng A/HongKong/156/97 thuộc clade 0 thì có sự khỏc biệt khỏ lớn: sự sai khỏc về mức ủộ nucleotide tới 10% và về mức ủộ axit amin tới 7%. Một chủng virus A/H5N1 khác cũng thuộc clade 0 là chủng A/Goose/Guangdong/1/96, ủược coi là thủy tổ của cỏc chủng virus cỳm A/H5N1ủộc lực cao, cú ủộ sai khỏc về di truyền với cỏc chủng virus thuộc clade 7 của Việt Nam ở mức ủộ nucleotide là 5,3±0.2% (5,2-5,6%) và ở mức ủộ axit amin là 4,2±0.2 % (4,1-4,4%).
Tóm lại, kết quả phân tích phát sinh loài, kết quả phân tích sự sai khác di truyền dựa trên gen H5, N1 và M của các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam cho thấy, cỏc chủng virus thuộc clade 7 của Việt Nam cú ủộ tương ủồng cao với nhau chứng tỏ chỳng cú cựng nguồn gốc, và tương ủồng với cỏc chủng virus A/H5N1 cũng thuộc clade 7 phân lập ở Trung Quốc.
Từ các kết quả trên có thể kết luận rằng các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7 của Việt Nam cùng nguồn gốc với các virus thuộc clade 7 của Trung Quốc, và xâm nhập vào Việt Nam chứ không phải là các virus tiến hóa từ cỏc chủng virus cỳm A/H5N1ủộc lực cao gõy bệnh trước ủú trờn gia cầm (2003- 2008) tại Việt Nam. Hiện tượng cỏc chủng virus thuộc clade 7 ủược phỏt hiện ở vùng biên giới năm 2008, cùng với sự xuất hiện của nhiều clade khác ở Việt Nam như clade 2.3.4 và 2.3.2 ở Việt Nam rất giống với những chủng virus cúm A/H5N1 lưu hành và gây bệnh trên gia cầm ở Trung Quốc cho thấy nguy cơ xâm nhập và xuất hiện của các chủng virus cúm A/H5N1từ bên ngoài vào Việt Nam là rất lớn, vì vậy cần phải tăng cường công tác giám sát nhằm phát hiện sớm những virus cỳm A/H5N1cú thể sẽ xõm nhập hoặc ủang lưu hành trờn gia cầm ở Việt Nam.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
83
Bảng 3.8. So sỏnh mức ủộ khỏc biệt về di truyền trờn gen M của 5 chủng virus cỳm A/H5N1 thuộc clade 7 so sánh với một số chủng tham chiếu
Ký hiệu
chủng Tên chủng virus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Axit amin (%) 1 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 0,6 0,3 0,3 0,3 1,6 1,3 3,5 1,9 7,4 1,9 2,1 3,8 4,4 7,4 2 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 1,0 0,3 0,3 0,3 1,6 1,3 3,5 1,9 7,4 1,9 1,8 3,8 4,4 7,4 3 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 0,9 0,3 0,0 0,0 1,3 0,9 3,2 1,6 7,1 1,6 1,8 3,5 4,1 7,1 4 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 0,9 0,3 0,2 0,0 1,3 0,9 3,2 1,6 7,1 1,6 1,8 3,5 4,1 7,1 5 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 0,9 0,3 0,2 0,0 1,3 0,9 3,2 1,6 7,1 1,6 1,8 3,5 4,1 7,1
6 A/chicken/Shandong/A-10/2006 1,3 1,3 1,2 1,2 1,2 0,9 3,8 1,6 7,4 1,6 1,8 3,5 4,4 7,4
7 A/chicken/Shanxi/10/2006 0,8 0,9 0,8 0,8 0,8 0,8 4,1 1,6 7,4 1,6 1,8 3,5 4,4 7,4
8 A/chicken/Shanxi/2/2006 3,1 3,1 2,8 2,9 2,9 2,8 3,0 3,2 7,4 3,2 3,5 5,1 5,8 7,4
9 A/Beijing/01/2003_2003 2,4 2,4 2,3 2,3 2,3 1,7 2,1 3,5 5,8 0,0 0,7 1,9 2,8 5,8
10 A/goose/Vietnam/3/05 10,0 10,1 9,7 9,7 9,7 10,0 10,4 9,3 8,7 5,8 5,7 5,8 3,8 0,0
11 A/Anhui/2/2005 3,0 3,1 3,0 3,0 3,0 2,4 2,7 4,0 0,9 8,1 0,7 1,9 2,8 5,8
12 A/blackheadedgoose/Qinghai/1/2005 3,2 3,2 3,2 3,2 3,2 2,6 2,7 4,0 1,4 9,3 1,3 2,1 3,2 5,7
13 A/goose/Fujian/bb/2003 4,0 4,1 3,8 3,8 3,8 3,4 3,7 4,4 2,1 8,1 2,0 2,3 2,8 5,8
14 A/Goose/Guangdong/1/96 5,5 5,6 5,2 5,2 5,2 5,0 5,3 5,7 3,5 6,0 3,4 3,8 3,2 3,8
15 A/Hong_Kong/156/97 10,7 10,8 10,5 10,5 10,5 10,7 11,1 9,3 9,4 1,3 8,8 9,8 8,8 7,5 Nucleotide (%)