CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3. Xỏc ủịnh một số ủặc tớnh sinh học của virus A/H5N1 clade 7 phõn lập ở Việt Nam (A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008)
3.3.4. Kết quả ủỏnh giỏ ủộ bài thải của virus trờn ủộng vật thớ nghiệm sau gây nhiễm
Bên cạnh việc theo dõi lâm sàng hàng ngày trong suốt thời gian thực hiện thớ nghiệm gõy nhiễm bệnh, chỳng tụi ủó tiến hành thu thập mẫu dịch ngoỏy hầu họng (swab) của những gà thí nghiệm chết hoặc sống vào ngày thứ 4 sau khi gây nhiễm ủể ủỏnh giỏ ủộ bài thải của virus. Cỏc tăm bụng ngoỏy hầu họng ủược bảo quản trong dung dịch ủệm PBS (1 ml), sau ủú chiết tỏch RNA bằng kớt Qiagen RNeasy minitkit, và xét nghiệm bằng phản ứng realtime RT- PCR theo quy trình xét nghiệm của Cục Thú y.
Bảng 3.16: đánh giá ựộ bài thải virus khi gây nhiễm bằng virus A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
ðVTN Gà Vịt Ngan
Stt
Ct
Chuyển ủổi (mức ủộ bài
thải)
Ct Chuyển ủổi Ct Chuyển ủổi
1 25,3 ++ Âm tính - 27,8 ++
2 21,7 +++ Âm tính - 33,7 +
3 23,9 +++ Âm tính - 24,9 +++
4 20,7 +++ Âm tính - 34,1 +
5 28,5 ++ Âm tính - 26,4 ++
6 23,2 +++ Âm tính - 32,6 +
7 22,5 +++ Âm tính - Âm tính
8 19,9 ++++ Âm tính - Âm tính
9 20,6 +++ Âm tính - 31,7 +
10 25,2 ++ Âm tính - 31,3 +
11 22,2 +++
Trung bình 23,1 +++ (3) Âm tính - (0) 31,0 +(1)
Tỷ lệ nhiễm 100% 0% 80%
Chú thích: Ct – Cycle threshold (ngưỡng chu kỳ của phản ứng RRT-PCR)
Kết quả xột nghiệm RRT-PCR ủược thể hiện bằng giỏ trị Ct (Cycle threshold – giá trị ngưỡng chu kỳ của phản ứng). Giá trị Ct có tỷ lệ nghịch với mức ủộ virus cú trong mẫu kiểm tra. Nghĩa là nếu trong mẫu kiểm tra cú lượng virus cao thì giá trị Ct khi xét nghiệm bằng RRT-PCR thấp và ngược lại, nếu lượng virus có trong mẫu thấp thì giá trị Ct sẽ cao. Mẫu có giá trị Ct ~35 trở xuống là dương tính.
Do giá trị Ct tỷ lệ nghịch với lượng virus có trong mẫu xét nghiệm, nên chỳng tụi quy ước giỏ trị Ct sang mức ủộ từ + ủến ++++ ủể dễ biểu thị kết quả về lượng virus cú trong mẫu kiểm tra. Cụ thể như sau: Mẫu cú Ct ≤ 20 ủược coi là ++++(4), Ct từ < 20 ủến ≤ 25 ủược coi là +++(3), Ct từ < 25 ủến ≤ 30 ủược coi là ++(2) và Ct từ < 30 ủến ≤ 35 ủược coi là +(1). Dựa vào mức ủộ của từng mẫu riờng lẻ và tớnh trung bỡnh cho từng loài ủộng vật thớ nghiệm. Kết quả ủược trỡnh bảy ở bảng 3.16.
- Kết quả nhiễm bệnh như ủó thấy khi quan sỏt lõm sàng ủó rất rừ trờn gà, toàn bộ số gà gõy bệnh ủều ốm, chết với tỷ lệ 100% và số mẫu swab của gà thớ nghiệm ủều dương tớnh virus cỳm A/H5N1 khi xột nghiệm bằng phản ứng RRT- PCR.
- Khi xột nghiệm mẫu trờn vịt thấy toàn bộ cỏc mẫu kiểm tra ủều õm tớnh, chứng tỏ virus cúm A/H5N1 clade 7 không có khả năng gây nhiễm, hay nói cách khác là không có khả năng thích nghi trên vịt. ðiều này cũng phù hợp với thực tế, khi ở Trung quốc cũng chỉ phát hiện thấy virus A/H5N1 thuộc clade 7 trên gà mà không phát hiện thấy trên vịt (Jiang và cs, 2010).
- Tuy nhiờn, kết quả xột nghiệm RRT-PCR ủối với cỏc mẫu dịch ngoỏy họng ngan lại cú kết quả khỏc với kết quả của cỏc mẫu từ vịt ủược gõy bệnh. Cú 8 trên 10 mẫu ngan cho kết quả dương tính virus cúm khi xét nghiệm bằng RRT- PCR, mặc dự toàn bộ số ngan ủều khỏe mạnh về mặt lõm sàng như ủó trỡnh bày ở trên. ðiều này có nghĩa là ngan có thể nhiễm virus cúm A/H5N1clade 7 nhưng không mắc bệnh.
Về chi tiết mức ủộ virus bài thải, hầu hết cỏc mẫu swab lấy từ gà (8/11 mẫu) ủều cú mức ủộ là 3 - 4 (+) giỏ trị Ct nằm trong khoảng 19,9 - 23,9, và chỉ cú một số ớt mẫu (3/11 mẫu) ở mức ủộ 2 (+). Tớnh trung bỡnh, mức ủộ bài thải virus cỳm ở gà nhiễm virus cỳm A/H5N1clade 7 là mức ủộ 3(+). Kết quả này
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
105
cho thấy khi gà bị nhiễm virus cúm A/H5N1clade 7 sẽ bài thải lượng lớn virus trước khi chết. ðiều này cũng ủược quan sỏt thấy khi chỳng tụi kiểm tra ủộ bài thải virus khi gây bệnh cho gà với các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 1 và clade 2.3.4.
Như ủó ủề cập bờn trờn, vịt khụng hề nhiễm virus cỳm A/H5N1clade 7 sau khi công, nhưng ngan vẫn có khả năng nhiễm virus này. Tuy số ngan bị nhiễm virus là khỏ cao (80%), nhưng mức ủộ bài thải virus khụng cao, chủ yếu là ở mức ủộ 1(+). Cỏc nghiờn cứu trước ủõy cho thấy virus cỳm A/H5N1ủộc lực dạng cổ ủiển thường cú ủộc lực cao trờn gà nhưng khụng gõy nhiễm cho thuỷ cầm giống như virus cúm A/H5N1clade 7, tuy nhiên chúng vẫn có khả năng nhân lên rất tốt trên thuỷ cầm và bài thải với lượng lớn ra ngoài. Nhưng kết quả nghiên cứu của chỳng tụi cho thấy, khỏc với cỏc virus cỳm dạng cổ ủiển, chủng virus A/H5N1 thuộc clade 7 mà chỳng tụi ủó phõn lập cú khả năng gõy nhiễm rất hạn chế trờn thuỷ cầm.
Cú một ủiều ủỏng chỳ ý là, khi chỳng tụi gõy nhiễm virus cỳm thuộc clade 7 trên môi trường tế bào xơ phôi vịt và xơ phôi ngan, virus này lại có khả năng nhân lên rất tốt giống như khả năng nhân lên trên tế bào xơ phôi gà. Cụ thể chuẩn ủộ (giỏ trị TCID50)của virus cỳm A/H5N1clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD- 016) trờn tế bào xơ phụi vịt và tế bào xơ phụi ngan lần lượt là 107,3 và 106,7(ủó trình bày ở phần 3.3.2.)
Cho ủến nay, chỳng tụi chưa phỏt hiện thấy virus cỳm A/H5N1 clade 7 này trong các ổ dịch cúm gia cầm ở Việt Nam, ngoại trừ trên một số gia cầm tại chợ gia cầm sống khi tiến hành chương trình giám sát virus. ðiều này có thể là do virus này không có hoặc ít có khả năng thích nghi tốt trên thuỷ cầm, mà thuỷ cầm ủó ủược chứng minh là yếu tố quan trọng làm lõy lan virus cỳm và là nguồn lưu trữ virus ngoài môi trường.
Tuy nhiên khi theo dõi tình hình dịch cúm gia cầm và kết quả giám sát cỳm gia cầm ủộc lực cao H5N1 của Trung Quốc, chỳng tụi nhận thấy bờn cạnh các ổ dịch gây ra bởi virus cúm A/H5N1thuộc clade 2.3.4 và 2.3.2 thì vẫn có nhiều ổ dịch gõy ra bởi virus thuộc clade 7 trong giai ủoạn 2007-2010 ở cỏc tỉnh phía Bắc của Trung Quốc (Jiang và cs, 2010). Thậm chí có một số ca bệnh trên người ở Trung Quốc là do virus cúm gia cầm H5N1 Clade 7 gây ra. ðiều này cho
thấy, chúng ta không thể chủ quan với công tác giám sát virus cúm gia cầm, vì virus cỳm A/H5N1núi chung cú khả năng biến ủổi liờn tục và virus cỳm A/H5N1Clade 7 hoàn toàn cú thể gõy ra dịch cỳm gia cầm ở nước ta như ủó từng thấy virus các chủng virus cúm A/H5N1clade 2.3.2 xuất hiện lại ở các ổ dịch ở Việt Nam và Trung Quốc trong năm 2009-2011, và nhỏnh virus 2.3.2. ủó cú biến ủổi khỏ nhiều, ủược gọi là clade 2.3.2.1 (Nguyen, 2010).