CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. Xỏc ủịnh ủặc tớnh di truyền của virus cỳm A/H5N1 thuộc clade 7 phõn lập ở Việt Nam (bằng phương pháp giải trình tự và lập cây phả hệ)
3.2.1. Giải trình tự gen HA (H5) và phân tích cây phả hệ sử dụng chuỗi gen H5
Trong số 15 mẫu ủược xỏc ủịnh là virus cỳm A/H5N1 clade 7, cú 5 mẫu ủó phõn lập ủược virus, cũn 10 mẫu cũn lại chỉ cho kết quả dương tớnh bằng phương phỏp Realtime RT-PCR. Cả 15 mẫu này ủều ủược chỳng tụi tiến hành chiết tỏch RNA của virus và sau ủú sử dụng phản ứng RT-PCR ủể khuếch ủại gen HA ủể giải trỡnh tự gen tại phũng thớ nghiệm cỳm của CDC-Hoa Kỳ.
Bảng 3.2. Kết quả giải trình tự gen và phân tích cây phát sinh loài các chủng virus cúm A/ H5N1 phát hiện ở Lạng Sơn Số
TT Tờn chủng virus cỳm phõn lập ủược ðịa ủiểm phát hiện
Phân loai
clade/nhóm Subtype
1 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 Cao Lộc 7 H5N1
2 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 Cao Lộc 7/Nhóm B H5N1 3 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 Cao Lộc 7/Nhóm B H5N1 4 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 Cao Lộc 7/Nhóm B H5N1 5 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 Cao Lộc 7/Nhóm A H5N1
Tên mẫu dương tính virus cúm (không phõn lập ủược virus)
6 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/2008 Cao Lộc 7/Nhóm B H5N1 7 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/2008 Lộc Bình 7/Nhóm A H5N1 8 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/2008 Lộc Bình 7/Nhóm B H5N1 9 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/2008 Lộc Bình 7/Nhóm A H5N1 10 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/2008 Lộc Bình 7/Nhóm A H5N1
11 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/2008 Cao Lộc 7 H5N1
12 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/2008 Cao Lộc 7/Nhóm B H5N1 13 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/2008 Lộc Bình 7/Nhóm B H5N1 14 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/2008 Lộc Bình 7/Nhóm B H5N1 15 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/2008 Lộc Bình 7/Nhóm B H5N1
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
63
Tờn của cỏc mẫu ủó phõn lập ủược virus cỳm A/H5N1và tờn của cỏc mẫu RNA ủó phỏt hiện dương tớnh virus cỳm A/H5N1 ủược ủặt theo danh phỏp quốc tế: Tên type cúm A/Lồi/Tên nước/Tên viết tắt Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương bằng tiếng Anh-ký hiệu của virus hoặc mẫu. Kết quả chi tiết về các mẫu ủó phõn lập và phỏt hiện dương tớnh virus cỳm A/H5N1 ủược trỡnh bày ở bảng 3.2.
Tỡm kiếm sự tương ủồng của cỏc virus cỳm ủược thực hiện bằng chương trình BLAST trên ngân hàng dữ liệu (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) sử dụng chuỗi nucleotide của gen HA cho thấy, cỏc mẫu virus này cú ủộ tương ủồng rất cao với hai chủng virus ủó ủược mụ tả trước ủõy là virus A/chicken/Hebei/326/2005/H5N1 và virus A/chicken/Shanxi/2/2006/H5N1 (ủộ tương ủồng trung bỡnh của gen HA ở mức ủộ nuleotide lần lượt là 96,1% và 96,3%) và cả 15 mẫu này ủều ủược sắp xếp nằm trong một nhúm.
Phân tích trình tự gen bằng phương pháp lập cây phả hệ (phylogenetic tree) ủể tỡm kiếm tổ tiờn (nguồn gốc) của 15 mẫu virus cỳm này cho thấy gen HA của các virus nằm chung một nhóm với một nhóm phụ của các virus cúm H5N1 trước ủõy cú gen HA ủược phõn loại là clade 7. Tờn một số chủng virus cỳm A/H5N1 của tất cả cỏc clade từ 0-9 sử dụng ủể xõy dựng cõy phỏt sinh loài gen HA/H5 ủược thể hiện ở bảng 3.3. Trong số mẫu xột nghiệm trờn ủõy chỳng tụi không phát hiện thấy mẫu virus A/H5N1 thuộc clade 2.3.4. ðiều này cũng có thể hợp lý vỡ thực ra virus A/H5N1 clade 2.3.4 ủó xõm nhập vào Việt Nam từ năm 2007.
Một ủiều chỳ ý là, khi quan sỏt trờn cõy phỏt sinh loài dựa trờn gen HA cú thể thể thấy rõ có 13 trong số 15 mẫu virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam tỏch thành 2 nhúm nhỏ rừ rệt (xem hỡnh 3.2.), tạm ủược gọi là nhúm A và nhúm B ủể phõn tớch (tờn cụ thể của từng mẫu trong mỗi nhúm A và B ủược tỡnh bày trong bảng 3.2.). Thờm vào ủú, 2 mẫu virus cỳm A/Chicken/Vietnam/NCVD- 016/2008 và A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/2008 dường như ủó chiếm vị trớ
trung gian trong cây phả hệ, gần với gốc của 2 nhóm nhưng không .
Hình 3.2. Cây phả hệ ỗi nucleotide gen H5 củ
/H5N1 clade 7 (ðược lập bằng phương pháp phân tích Neighbor- joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000)
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
65
Khoảng cách tiến hóa của gen HA giữa 2 nhóm A và B cho thấy sự khác biệt giữa cỏc dũng virus nằm trong clade 7 này ủược chỉ ra bằng ủộ dài của cỏc nhánh trong cây phả hệ (Hình 3.2.) cũng như khoảng cách trung bình nucleotide của chỳng ủối với tổ tiờn clade 7 gần nhất (virus A/chicken/Shanxi/2/2006). ðể ủịnh lượng sự dị biệt di truyền giữa cỏc mẫu virus A/H5N1 này và cỏc virus A/H5N1 khỏc, chỳng tụi tiến hành so sỏnh theo cặp ủụi về sự khỏc biờt theo tỷ lệ phần trăm với chuỗi nucleotide và chuỗi axit amin (Bảng 3.4.)
Trong phân tích sự khác biệt di truyền gen HA của virus A/H5N1 clade 7 của Việt Nam và các chủng virus A/H5N1 tham chiếu, chúng tôi chỉ lựa chọn các mẫu mà ủó phõn lập ủược virus vỡ sau này tiếp tục sử dụng cỏc mẫu virus phõn lập cho việc nghiờn cứu ủặc tớnh khỏng nguyờn. Kết quả phõn tớch sự khỏc biệt di truyền gen HA ủược trỡnh bày ở bảng 3.4.
Cỏc chủng virus ủại diện từ một số clade H5N1 khỏc nhau (clade 0, clade 1, clade 4, clade 2.1.3, clade 2.2, clade 2.3.4 và clade 7) ủó ủược sử dụng trong phõn tớch này ủể cung cấp cỏc tham chiếu nhằm so sỏnh mức ủộ của sự khỏc biệt về di truyền giữa các mẫu virus cúm A/H5N1 clade 7 mới phát hiện với nhau và giữa chỳng với một số clade khỏc ủó ủược bỏo cỏo trước ủõy (Weiss, 2003).
Các gen HA của 2 nhóm virus A hoặc B cho thấy sự khác biệt trong cùng nhúm ở mức ủộ rất thấp ủối với chuỗi nucleotide cũng như chuỗi axit amin, cụ thể sự khác biệt trung bình tổng thể về nucleotide là 0,39% và về axit amin là 0,38%. Ngược lại, sự khỏc nhau giữa hai nhúm A và nhúm B ủạt trung bỡnh 4,05% và 5,69% lần lượt ở cỏc mức ủộ nucleotide và axit amin trờn khắp vựng gen HA mã hóa.
Cũng trong năm 2007 – 2009, Trung Quốc cũng phát hiện ra nhiều chủng virus cỳm A/H5N1 khỏc nhau trong ủú cú virus cỳm A/H5N1 thuộc clade 7.
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc (Jiang và cs, 2010) các virus A/H5N1 clade 7 phõn lập trong giai ủoạn này cũng khỏc biệt một cỏch rừ rệt với những virus ủược phõn lập từ trước ủú, với sự khỏc biệt trung bỡnh về chuỗi nucleotide trên gen HA là 5,4%.
Bảng 3.3. Danh sỏch cỏc chủng virus cỳm A/H5N1 dựng ủể so sỏnh và lập cây phát sinh loài dựa trên gen H5
Stt Tên chủng Clade Loài mắc
Năm phân lập
Nơi phân lập
Số ủăng ký ngân hàng
gen 1 A/goose/Guangdong/1/96 0 Ngỗng 1996 Trung Quốc AF144305 2 A/Hong Kong/156/97 0 Người 1997 Hong Kong AF036356 3 A/Hong Kong/213/03 1 Người 2003 Hong Kong DQ992842 4 A/Viet Nam/1194/2004 1 Người 2004 Việt Nam EF541402 5 A/Viet Nam/1203/2004 1 Người 2004 Việt Nam HM006759 7 A/Cambodia/JP52a/2005 1 Người 2005 Campuchia EF456805 6 A/Viet Nam/HN30408/2005 1 Người 2005 Việt Nam EF456803 9 A/Muscovy duck/Vietnam/4/2007 1 Ngan 2007 Việt Nam AB593439 8 A/duck/Vietnam/1/2007 1 Vịt 2007 Việt Nam CY029559 10 A/chicken/Indonesia/11/2003 2.1.1 2.1 Gà 2003 Indonesia EF473081 11 A/Indonesia/CDC594/2006 2.1.2 2.1 Người 2006 Indonesia CY014272 12 A/Indonesia/CDC1032/2007 2.1.3 2.1 Người 2007 Indonesia CY019384 15 A/whooper swan/Mongolia/244/2005 2.2 Chim hoang 2005 Mông Cổ GU186700 16 A/turkey/Turkey/1/2005 2.2 2.2 Gà Tây 2005 Thổ Nhĩ Kỳ EF619980 17 A/bar-headed goose/Qinghai/1A/2005 2.2 Chim hoang 2005 Trung Quốc DQ659327 13 A/chicken/Egypt/9403-clevb214/2007 2.2 Gà 2007 Ai Cập EU623468 14 A/Egypt/1394-NAMRU3/2007 2.2 Người 2007 Ai Cập EF535817 19 A/Egypt/321-NAMRU3/2007 2.2 Người 2007 Ai Cập EF535822 18 A/Nigeria/6/07 2.2 2.2 Người 2007 Nigeria EU146920 21 A/duck/Hunan/127/2005 2.3.1 2.3.1 Vịt 2005 Trung Quốc DQ320902 20 A/duck/Hunan/139/2005 2.3.1 2.3.1 Vịt 2005 Trung Quốc DQ320903 25 A/Chicken/Shantou/810/05 2.3.2 2.3.2 Gà 2005 Trung Quốc DQ095626 22 A/duck/Vietnam/568/2005 2.3.2 2.3.2 Vịt 2005 Việt Nam DQ320939 23 A/chicken/Primorje/1/2008 2.3.2 2.3.2 Gà 2008 Nga EU676174 24 A/whooper swan/Hokkaido/1/2008 2.3.2 2.3.2 Chim hoang 2008 Nhật Bản AB436550 26 A/chicken/Guiyang/3055/2005 2.3.3 2.3.3 Gà 2005 Trung Quốc DQ992755 27 A/goose/Guiyang/3422/2005 2.3.3 2.3.3 Ngỗng 2055 Trung Quốc DQ992757 28 A/duck/Laos/3295/2006 2.3.4 Vịt 2006 Lào FJ147207
29
A/Japanese white-eye/Hong
Kong/1038/2006 2.3.4 Chim 2006 Nhật Bản HM172104
30 A/Anhui/1/2005 2.3.4 Người 2006 Trung Quốc HM172104
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
67
Stt Tên chủng Clade Loài mắc
Năm phân lập
Nơi phân lập
Số ủăng ký ngân hàng
gen 31 A/Muscovy duck/Vietnam/48/2007 2.3.4 Ngan 2007 Việt Nam CY029695 32 A/Muscovy duck/Vietnam/54/2007 2.3.4 Ngan 2007 Việt Nam CY029743 33 A/Viet Nam/HN31242/2007 2.3.4 Người 2007 Việt Nam EU294369 34 A/duck/Guangxi/13/2004 2.4 Vịt 2004 Trung Quốc DQ366338 35 A/chicken/Yunnan/493/2005 2.4 Gà 2005 Trung Quốc DQ095625 36 A/chicken/Yamaguchi/7/2004 2.5 Gà 2004 Nhật Bản GU186708 37 A/chicken/Guangdong/174/04 2.5 Gà 2004 Trung Quốc AY609312 39 A/duck/Fujian/17/2001 3 Vịt 2001 Trung Quốc AY585372 38 A/Chicken/Hong_Kong/715.5/01 3 Gà 2002 Hong Kong AF509025 40 A/goose/Fujian/bb/2003 4 Ngỗng 2003 Trung Quốc DQ997405 41 A/goose/Guiyang/1175/2006 4 Ngỗng 2006 Trung Quốc DQ992771 42 A/goose/Guiyang/337/2006 4 Ngỗng 2006 Trung Quốc DQ992765 43 A/chicken/Jilin/ho/2003 5 Gà 2003 Trung Quốc DQ997355 44 A/chicken/Viet_Nam/Ncvd8/2003 5 Gà 2003 Việt Nam EF541407 45 A/duck/Hubei/wg/2002 6 Vịt 2002 Trung Quốc DQ997094 46 A/blackbird/Hunan/1/2004 6 Chim hoang 2004 Trung Quốc AY741213 51 A/Beijing/01/2003 7 Người 2003 Trung Quốc EF587277 47 A/treesparrow/Henan/2/2004 7 Chim 2004 Trung Quốc AY741217 50 A/domestic mallard/Hunan/79/2005 7 Chim hoang 2005 Trung Quốc EU430511 52 A/chicken/Hebei/326/2005 7 Gà 2005 Trung Quốc DQ343150 49 A/goose/Yunnan/3315/2005 7 Ngỗng 2005 Trung Quốc DQ992794 48 A/duck/Yunnan/5133/2005 7 Vịt 2005 Trung Quốc DQ992801 53 A/chicken/Shanxi/2/2006 7 Gà 2006 Trung Quốc DQ914814 55 A/chicken/Hong_Kong/61.9/02 8 Gà 2002 Hong Kong AY575876 54 A/chicken/Hong_Kongi/86.3/2002 8 Gà 2002 Hong Kong DQ320927 57 A/chicken/Hubei/14/2004 9 Gà 2004 Trung Quốc EF670482 56 A/chicken/Hubei/489/2004 9 Gà 2004 Trung Quốc AY770079
Mặc dù các gen HA của nhóm A hoặc B có sự khác biệt rất rất thấp trong nhóm về chuỗi nucleotide hoặc axit amin, nhưng sự khác biệt giữa hai nhóm này ủạt trung bỡnh 4,1% ở mức ủộ nucleotide và 5,7% ở mức ủộ axit amin trờn gen HA (Bảng 3.4). Mức ủộ khỏc biệt cao tương ủương với sự thay thế ≥ 30 axit amin giữa các chuỗi protein HA ở hai nhóm.
Ngoài ra, các số liệu về sự khác biệt trung bình của tất cả các virus clade 7 ủó giải trỡnh tự trong nghiờn cứu này so với virus H5N1 clade 7 cú mối quan hệ gần nhất về gen HA là A/chicken/Shanxi/2/2006 là 3,8% (3,3-3,9%) ở mức ủộ nucleotide và 5,8% (5,4-6,1%) ở mức ủộ và axit amin (Bảng 3.4). Túm lại, những dữ liệu này cho thấy virus A/chicken/Shanxi/2/2006 là tổ tiên gần nhất của clade 7 HA gen ủược xỏc ủịnh trong nghiờn cứu này.
So sánh gen HA của những chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam với những chủng ủại diện từ cỏc clade khỏc của virus cỳm A/H5N1 như clade 0, clade 4, clade 1, clade 2.1.3, clade 2.2 và clade 2.3.4 cho thấy gen HA ở cấp ủộ axit amin liờn quan gần nhất với virus nguyờn mẫu thuộc clade 4 là A/goose/Guiyang/337/2006 với sự khác biệt axit amin là 8,2-9,0% (trung bình là 8,38%) và liờn quan xa nhất ủối với virus nguyờn mẫu clade 1 là A/Vietnam/1203/2004 với sự khác biệt axit amin trung bình là 9,0-9,7% (trung bình là 9,28%).
Trong số những chủng virus A/H5N1 thuộc các clade HA khác nhau, chủng virus cỳm A/H5N1 thuộc clade 0 (A/goose/Guangdong/1/1996) ủược sử dụng ủể sản xuất vacxin cỳm gia cầm H5N1 (Re-1) ủang sử dụng ở Việt Nam từ năm 2005 ủến nay. Mức ủộ khỏc biệt trung bỡnh ở cấp ủộ axit amin giữa cỏc chủng virus cỳm A/H5N1 clade 7 phõn lập ở Việt Nam ủối với virus A/goose/Guangdong/1/1996 là 8,86% (8,4-9,1%). ðây là sự khác nhau khá lớn về di truyền, do vậy cần phải xỏc ủịnh rừ khi gia cầm ủược tiờm vacxin H5N1 Re-1, liệu kháng thể tạo ra có thể bảo hộ chống lại virus cúm A/H5N1clade 7 hay khụng. ðiều này sẽ ủược chỳng tụi trỡnh bày rừ tại phần 3.3.6 và 3.3.7 của luận án này.
Khi phân tích gen HA của 15 mẫu virus cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam, chỳng tụi nhận thấy, cỏc mẫu virus nhúm B cú những thay ủổi về di truyền ủỏng kể nhất. Bờn cạnh sự thay ủổi codon thường xuyờn ủược quan sỏt thấy gõy ra hiện tượng thay thế axit amin, cũn xỏc ủịnh ủược cú những sự chốn và xúa cỏc codon ủầy ủủ khi so sỏnh với cỏc gen HA của những chủng virus tổ tiờn thuộc clade 7 (hình 3.3).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
69
Bảng 3.4. So sỏnh mức ủộ khỏc biệt về di truyền trờn gen HA của 5 chủng virus A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu
Ký hiệu
chủng Virus (Xắp xếp theo clade) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Axit amin (%)
1 A/goose/Guangdong/1/1996 (0) 3,9 3,8 4,3 4,3 4,5 3,6 6,5 8,4 9,1 9 8,8 9
2 A/goose/Guiyang/337/2006 (4) 4 4,8 5,6 6,1 5,9 4,3 7 8,2 9 8,2 8,1 8,4
3 A/Viet Nam/1203/2004 (1) 3,5 4,5 3,2 3,4 3,4 4,7 7,2 9 9,7 9,3 9,1 9,3
4 A/Indonesia/5/2005 (2.1.3) 4,4 5,4 3,7 3,6 3,2 4,5 7 8,4 9,5 8,8 8,6 9
5 A/bar-headed goose/Qinghai/1/2005 (2.2) 4,3 5,4 3,5 3,5 3,1 5 7,9 8,6 9,1 9,1 9 9,1
6 A/Anhui/1/2005 (2.3.4) 4 5,3 3,3 3,4 3,1 4,5 7,2 9 9,1 9,1 9 9,1
7 A/Beijing/01/2003 (7) 3,1 4 3,7 4,6 4,4 4,1 5 7 7,9 7,2 7 7,4
8 A/chicken/Shanxi/2/2006 (7) 4,6 5,7 5,3 6 6,2 5,6 3,3 5,4 5,9 5,9 5,7 6,1
9 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 (7, Vietnam) 6,2 6,5 6,6 7,1 6,9 6,8 4,4 3,3 6,1 3,2 3,1 3,4
10 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 (7, Vietnam, nhóm A) 6,3 6,7 6,8 7,3 7,1 6,9 4,7 3,6 4 5,7 5,6 5,9
11 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 (7, Vietnam, nhóm B) 6,8 6,8 7 7,5 7,3 7 4,7 3,9 2,8 4,1 0,2 0,5
12 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 (7, Vietnam, nhóm B) 6,7 6,7 6,9 7,5 7,2 7 4,7 3,9 2,8 4,1 0,1 0,4 13 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 (7, Vietnam, nhóm B) 6,6 6,6 6,9 7,4 7,2 6,9 4,6 3,8 2,7 4 0,4 0,3
Nucleotide (%)
Ghi chỳ -Chữ số trong ngoặc ( ) là clade của virus - Sự khỏc biệt axit amin ủược in ủậm
Trên cơ sở kết quả phân tích chuỗi nucleotide của gen HA (H5), chúng tôi có một số nhận xét sau:
- Các chủng virus A/H5N1 nhóm B thuộc clade 7 phát hiện ở Việt Nam ủều cú hiện tượng xúa mất một axit amin là alanine ở vị trớ 253 (dựa trờn việc ủỏnh số gen HA (H5) và chốn thờm 3 axit amin vào vị trớ polybasic gần cleavage site (chuỗi nối). Hiện tượng chèn axit amin ở virus nhóm B (các axit amin ủược gạch bờn dưới) tạo ra một chuỗi polybasic ở vị trớ chuỗi nối như sau PQREREGGRRRKR*GLF. (xem hình 3.3).
- Trong khi ủú, cỏc virus A/H5N1 nhúm A của clade 7 vẫn duy trỡ chuỗi trình tự axit amin thông thường PQIEGRRRKR*GLF như tất cả các gen HAH5 của cỏc virus cỳm A/H5N1 clade 7 khỏc. Cú một ủiều ủỏng chỳ ý là, virus A/chicken/ Vietnam/NCVD-016/2008, khi phân tích phát sinh loài, chúng tôi nhận thấy virus này dường như là virus tổ tiên (nguồn gốc) của cả 2 nhóm virus A và B thuộc clade 7 Việt Nam, bởi chủng virus này có một chuỗi poly basic trung gian mang một axit amin ủược chốn vào như của nhúm B (PQREGGRRRKR*GLF). (hình 3.3).
- Ở một chủng virus trung gian khác giữa 2 nhóm A và B là chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/2008, cũng có chuỗi trình tự trung gian với alanine bị xóa tại vị trí 253 và hiện tượng chèn một axit amin (glycine) gần vị trí cleavage site tạo nên chuỗi trình tự polybasic PQIEGGRRRKR*G giống như nhóm B (hình 3.3).
- Tất cả 15 mẫu virus cỳm A/H5N1clade 7 phõn lập ở Việt Nam ủều chứa motif glycosyl hóa liên kết-N còn nguyên vẹn tại vị trí 154-156 (NNT) phù hợp với sự glycosyl hóa thông thường ở vị trí này.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà N