CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. Xỏc ủịnh ủặc tớnh di truyền của virus cỳm A/H5N1 thuộc clade 7 phõn lập ở Việt Nam (bằng phương pháp giải trình tự và lập cây phả hệ)
3.2.2. Giải trình tự gen NA(N1) và phân tích
ến hành gi
- A/Chicken/Vietnam/NCVD - A/Chicken/Vietnam/NCVD - A/Chicken/Vietnam/NCVD - A/Chicken/Vietnam/NCVD - A/Chicken/Vietnam/NCVD Chiều dài của ủoạ
trình tự là 1346 nucleot ATG. Trình tự nucleotide c
p Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
ng chèn và xóa các axit amin tại vị /H5N
gen NA(N1) và phân tích cây phả hệ dựa trên chu
, song song với việc giải trình t n hành giải trỡnh tự 1 ủối với 5 m
1 cụ thể như sau:
/Vietnam/NCVD-016/2008 A/Chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 A/Chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 A/Chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 A/Chicken/Vietnam/NCVD-05/2008
ạn gen N1 của cỏc mẫ /H5N1clade 7 ủ là 1346 nucleotide, mó húa cho 448 axit amin, khởi ủầu b
nucleotide của gen N1 của các chủ ợc so sánh v a trên chuỗi
i trình tự i 5 mẫ
/H5N1clade 7 ủó giải u bằng bộ mã c so sánh với
chuỗi gen N1 tương ứng của một số chủng virus cúm A/H5N1của Việt Nam và Trung Quốc phỏt hiện trong giai ủoạn 1996-2010 gồm cú chủng virus A/goose/Guangdong/1/96 ủược coi là thủy tổ của virus cỳm A/H5N1 ủộc lực cao. Cùng với sự so sánh sự khác biệt về chuỗi nucleotide giữa các chủng virus chúng tôi tiến hành lập cây phả hệ của gen N1 dựa trên chuỗi nucleotide và kết quả ủược biểu diễn ở hỡnh 3.4. Cỏc chủng virus A/H5N1 sử dụng ủể lập cõy phỏt sinh loài cựng với cỏc chủng virus A/H5N1 thuộc clade 7 của Việt Nam ủược liệt kê ở bảng 3.5.
Hình 3.4 cho thấy kết quả phân tích phát sinh loài dựa trên gen N1 cũng ủồng nhất ủối với kết quả khi so sỏnh phỏt sinh loài dựa trờn gen H5. Nghĩa là gen N1 cỏc chủng virus cỳm A/H5N1 clade 7 phõn lập ở Việt Nam cũng cú ủộ tương ủồng cao ủối với gen N1 của cỏc chủng virus cỳm thuộc clade 7 của Trung Quốc và nằm thành nhóm với nhau trên cây phả hệ.
Quan sát chi tiết cây phả hệ cho thấy trong số 5 chủng virus A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam có 4 chủng là A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 và A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 nằm cụm lại thành nhóm với nhau. Trong khi ủú chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-093 lại nằm tỏch khỏ xa khỏi nhúm này và cú mức ủộ tương ủồng gần (nằm sỏt nhau trờn cõy phỏt sinh loài) với chủng virus thuộc clade 7 của Trung Quốc phân lập từ năm 2003 (A/Beijing/01/2003).
Kết quả so sánh về sự phân bố của các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 trong cây phả hệ gen H5 và N1, có thể nhận xét rằng giữa các chủng virus cúm A/H5N1clade 7 cũng cú sự tiến húa khỏc nhau ủối với gen N1, cụ thể là chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-093 khác biệt với nhóm còn lại của các virus clade 7 của Việt Nam. Tuy nhiên khi so sánh với các các chủng virus cúm A/H5N1của những clade khác, có thể nhận thấy rõ ràng là các virus cúm A/H5N1thuộc clade 7 của Trung Quốc cũng như Việt Nam ủều cú ủộ tương ủồng cao và khỏc biệt hoàn toàn với cỏc clade khỏc hiện tại ủang lưu hành trongkhu vực.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
Hình 3.4. Cây phả hệ dựa trên chuỗ
A/H5N1 clade 7(ðược lập bằng phương pháp phân tích neighbor-joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000)
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 A/chicken/Shanxi/10/2006
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/2008 A/chicken/Hebei/706/2005
A/chicken/Liaoning/A-1/2007 A/mallard/Huadong/hn/2005
A/chicken/Shanxi/2/2006 A/chicken/Ningxia/24/2006 A/chicken/Hebei/126/2005 A/chicken/Hebei/102/2005 A/chicken/Hebei/326/2005 A/Beijing/01/2003 2003
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/2008 A/Viet Nam/1194/2004
A/Viet Nam/1203/2004 A/chicken/Vietnam/8/2003
A/chicken/Viet Nam/AG-010/2004 A/Vietnam/CL20/2004
A/chicken/Viet Nam/DT-015/2004 A/chicken/Bac Lieu/07-10/2007
A/Muscovy duck/Ca Mau/07-04/2007 A/duck/Viet Nam/38ST/2008 A/duck/Hue/V6/2010
A/duck/Viet Nam/TMU026/2009 A/chicken/Viet Nam/TMU025/2009 A/duck/Hai Phong /208/2006
A/chicken/Bac Giang/07-74/2007 A/duck/Ha Tinh/07-53/2007 A/chicken/Ha Nam/07-83/2007
A/duck/Vietnam/8/05 A/goose/Vietnam/3/05
A/duck/Vietnam/1/2005 A/Hong Kong/485/1997 A/chicken/China/27402/1997
A/HongKong/486/97 A/HongKong/481/97 A/Hong Kong/156/97 A/duck/Guangxi/2291/2004
A/duck/Guangxi/1378/2004 A/chicken/Viet Nam/Ncvd8/2003
A/Hong Kong/213/2003 A/HK/212/03 2003 A/goose/Viet Nam/113/2001 A/Pheasant/HongKong/FY155/01 A/goose/Hong Kong/437-6/1999 A/Goose/Guangdong/3/97
A/Chicken/HongKong/YU822.2/01 A/Goose/Guangdong/1/96
40 72 52 99 95 51 100 81
100
55 100
100 98 100
95 100 83 50
70 61 46
100
85 97
92 68 79 73
89
99
99 97 95
98
71 91
89 90 69
99 65
49 86
99 54
0 . 0 0 5
Mất ủoạn 19 axớt amin
Virus clade 7 HA
20 axit amin
* *
*
*
*
Bảng 3.5. Danh sỏch cỏc chủng virus A/H5N1 sử dụng ủể so sỏnh và lập cõy phát sinh loài dựa trên gen N1
Stt Danh pháp quốc tế Loài
mắc
Năm phân lập
Nơi phân lập
Số ủăng ký ngân hàng
gen 1 A/goose/Guangdong/1/96 Ngỗng 1996 Trung Quốc AF144304 2 A/chicken/Hongkong/YU822/01 Gà 1997 Hong Kong AY221545 3 A/Hongkong/156/97 Người 1997 Hong Kong AF036357 4 A/Hongkong/481/97 Người 1997 Hong Kong AF102663 5 A/Hongkong/485/1997 Người 1997 Hong Kong AF102664 6 A/Hongkong/486/1997 Người 1997 Hong Kong AF102658 7 A/chicken/China/27402/1997 Gà 1997 Trung Quốc GU052122 8 A/goose/Guangdong/3/97 Ngỗng 1997 Trung Quốc AF364335 9 A/goose/Hongkong/437-6/1999 Ngỗng 1999 Hong Kong GU052021 10 A/pheasan/Hongkong/FY115/01 Trĩ 2001 Hong Kong AF509096 11 A/goose/Vietnam/113/2001 Ngỗng 2001 Việt Nam EF541474 12 A/Hongkong/212/2003 Người 2003 Hong Kong AY575881 13 A/Hongkong/213/2003 Người 2003 Hong Kong AB557744 14 A/Beijing/01/2003 Người 2003 Trung Quốc EF587279 15 A/chicken/Vietnam/8/2003 Gà 2003 Việt Nam DQ493042 16 A/chicken/Vietnam/ncvd8/2003 Gà 2003 Việt Nam EF541468 17 A/duck/Guangxi/1378/2004 Vịt 2004 Trung Quốc DQ321016 18 A/duck/Guangxi/2291/2004 Vịt 2004 Trung Quốc DQ321022 19 A/chicken/Vietnam/AG-010/2004 Gà 2004 Việt Nam DQ094278 20 A/chicken/Vietnam/DT-015/2004 Gà 2004 Việt Nam DQ094279 21 A/Vietnam/1194/2004 Người 2004 Việt Nam EF541466 22 A/Vietnam/1203/2004 Người 2004 Việt Nam HM006761 23 A/Vietnam/CL20/2004 Người 2004 Việt Nam DQ493071 24 A/chicken/hebei/102/2005 Gà 2005 Trung Quốc EU243134 25 A/chicken/hebei/126/2005 Gà 2005 Trung Quốc EU2431451 26 A/chicken/hebei/326/2005 Gà 2005 Trung Quốc DQ349118 27 A/chicken/hebei/706/2005 Gà 2005 Trung Quốc EU243127 28 A/mallard/huadong/hn/2005 Vịt trời 2005 Trung Quốc EU195410 29 A/goose/Vietnam/3/05 Ngỗng 2005 Việt Nam DQ366316 30 A/duck/Vietnam/1/05 Vịt 2005 Việt Nam DQ366308 31 A/duck/Vietnam/8/05 Vịt 2005 Việt Nam DQ366324 32 A/chicken/ningxia/24/2006 Gà 2006 Trung Quốc HM172205 33 A/chicken/shanxi/10/2006 Gà 2006 Trung Quốc HM172172 34 A/chicken/shanxi/2/2006 Gà 2006 Trung Quốc DQ914816 35 A/duck/Haiphong/208/2006 Vịt 2006 Việt Nam GU052504
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
75
Stt Danh pháp quốc tế Loài
mắc
Năm phân lập
Nơi phân lập
Số ủăng ký ngân hàng
gen 36 A/chicken/Liaoning/a-1/2007 Gà 2007 Trung Quốc HM172206 37 A/chicken/Bacgiang/07-74/2007 Gà 2007 Việt Nam GU050469 38 A/chicken/Baclieu/07-10/2007 Gà 2007 Việt Nam GU186763 39 A/chicken/Hanam/07-83/2007 Gà 2007 Việt Nam GU050477 40 A/muscovyduck/Camau/07-04/2007 Ngan 2007 Việt Nam GU186747 41 A/duck/Hatinh/07-53/2007 Vịt 2007 Việt Nam GU050430 42 A/duck/Vietnam/38ST/2008 Vịt 2008 Việt Nam FJ812005 43 A/chicken/Vietnam/TMU025/2009 Gà 2009 Việt Nam CY095702 44 A/duck/Hue/V6/2010 Vịt 2009 Việt Nam JN935005 45 A/duck/Vietnam/TMU026/2009 Vịt 2009 Việt Nam CY095705
Kết quả giải trình tự gen N1 cho thấy các chủng virus cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam cú hiện tượng bị ủột biến xúa (deletion) nờn bị mất 20 axit amin ở vị trớ từ 49-68 trờn vựng thõn của phõn tử khỏng nguyờn NA. Hiện tượng ủột biến xúa 20 axit amin này cũng ủó ủược quan sỏt thấy ở hầu hết cỏc virus cỳm phỏt hiện và phõn lập ủược ở Việt Nam và Trung Quốc từ năm 2004 ủến nay.
Cú một hiện tượng ủột biến khỏc trờn phõn tử khỏng nguyờn NA là sự mất ủoạn 19 axit amin ở cỏc chủng virus cỳm A/H5N1phõn lập ở Hong Kong năm 1997 (như chủng A/Hongkong/156/97) và một số chủng virus cúm A/H5N1phân lập ở Việt Nam năm 2005, tuy nhiờn cho ủến gần ủõy khụng cũn thấy cú sự xuất hiện ủột biến xúa 19 axit amin ở cỏc chủng virus A/H5N1 nữa. Hầu hết cỏc chủng virus A/H5N1 ủộc lực cao cổ ủiển (như chủng A/goose/Guangdong/1/96) ủều cú gen N1 với ủộ dài tối ủa (khụng cú ủột biến xúa axit amin) và hiện tượng này cũng chỉ cũn phỏt hiện thấy ở cỏc virus A/H5N1 phõn lập ủược cho ủến năm 2004.
Phần thõn khỏng nguyờn NA cú vai trũ quan trọng ủối với ủộc lực của virus cỳm gia cầm. Người ta ủó phỏt hiện hiện tượng ủột biến xúa 20 axit amin ở vị trớ 49-68 cú liờn quan ủến ủộc lực cao (Zhou và cs, 2006). Hiện tượng này cũng ủược phỏt hiện bởi Zhao và cs, 2007 (Zhao và cs, 2008) và ủiều ủú cú thể thể hiện sự thích nghi của virus cúm A/H5N1trên gia cầm (Matrosovich và cs, 1999).
Chúng tôi cũng thực hiện việc phân tích sự khác biệt di truyền trên gen N1 về mức ủộ nucleotide và mức ủộ axit amin của cỏc chủng virus A/H5N1 thuộc clade 7 thu thập ở Việt Nam và một số chủng virus A/H5N1 thuộc clade 7 của Trung Quốc (A/chicken/Shanxi/10/2006, A/chicken/Shanxi/2/2006, A/Beijing/01/2003) so sánh với một số chủng virus cúm A/H5N1 khác của Trung Quốc (A/HongKong/156/97, A/Goose/Guangdong/1/96) và của Việt Nam (A/VietNam/1194/2004, A/VietNam/1203/2004, A/goose/VietNam/113/2001, A/Goose/Guangdong/1/96). Kết quả trình bày ở bảng 3.6.
Khi so sỏnh mức ủộ khỏc biệt về di truyền giữa cỏc chủng virus cỳm A/H5N1clade 7 của Việt Nam chúng tôi nhận thấy sự sai khác giữa nhóm 4 virus cỳm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam ủó nờu phần trờn là A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 và A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 là rất thấp, ≤ 2% ở mức ủộ nucleotide và ≤2,7% ở mức ủộ axit amin. Cũng như ủó nhận thấy rừ như ở cõy phả hệ nhúm virus này cú ủộ khỏc biệt tương ủối lớn so với chủng virus khác của Việt Nam cũng thuộc clade 7 là A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008. Cụ thể sự sai khỏc về mức ủộ nucleotide và mức ủộ axit amin của nhúm 4 chủng virus mà chỳng tụi nờu trờn và virus A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 lần lượt là 4,7±0,2% (4,5-4,9%) và 5,6±0,3% (5,3-6,0%).
Kết quả phân tích cũng cho thấy chủng virus A/chicken/Vietnam/NCVD- 093 về mặt quan hệ hệ phả cũng gần nhất với chủng virus A/Beijing/01/2003, là chủng virus phân lập ở người năm 2003 của Trung Quốc. Cụ thể sự sau khác chỉ là 2,3% ở mức ủộ nucleotide và 2,5% ở mức ủộ axit amin.
Sự sai khác lớn nhất có thể quan sát thấy giữa các virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7 thu thập ở Việt Nam so với các chủng virus A/H5N1 có hiện tượng ủột biến xúa 19 axit amin (virus A/Hong_Kong/156/97 và virus A/goose/Vietnam/3/05) là 12,3-15,1% ở nucleotide và 9,5 - 10,4%.ở mức ủộ axit amin.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
77
Bảng 3.6. Mức ủộ khỏc biệt về di truyền trờn gen N1 của 5 chủng virus cỳm A/H5N1 clade 7 so sỏnh với một số chủng tham chiếu
Ký hiệu
chủng Tên chủng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Axit amin (%)
1 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 2,5 2,7 2,7 5,3 2,3 3,0 3,4 5,0 4,8 6,2 9,5 9,7 5,3
2 A/Chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 1,9 0,7 0,4 5,5 2,0 2,5 3,6 5,8 5,5 6,2 9,7 9,9 5,3
3 A/Chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 2,0 0,5 0,4 6,0 2,3 3,0 4,1 6,0 5,8 6,7 10,2 10,4 5,8 4 A/Chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 2,0 0,4 0,4 5,5 2,3 2,7 3,6 6,0 5,8 6,2 10,0 10,2 5,3
5 A/Chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 4,5 4,7 4,9 4,5 5,5 4,1 2,5 5,5 5,0 5,3 9,7 9,9 4,1
6 A/chicken/Shanxi/10/2006 1,6 1,4 1,6 1,7 4,5 2,7 3,6 5,5 5,5 6,5 10,2 10,4 5,3
7 A/chicken/Shanxi/2/2006 2,7 2,5 2,7 2,7 4,1 2,4 2,0 4,6 4,1 4,8 8,5 8,5 3,9
8 A/Beijing/01/2003 2,4 2,7 3,0 2,8 2,3 2,3 2,3 3,6 3,2 3,6 8,2 8,2 2,3
9 A/Viet_Nam/1194/2004 4,7 5,2 5,4 5,4 4,3 4,7 4,6 2,8 0,9 5,0 8,7 8,7 3,4
10 A/Viet_Nam/1203/2004 4,2 4,8 5,0 5,0 3,8 4,3 4,1 2,3 1,0 4,6 8,2 8,2 3,4
11 A/goose/Viet_Nam/113/2001 6,6 6,7 6,8 6,4 5,7 6,5 6,0 4,5 5,6 4,9 7,9 7,7 2,8
12 A/Hong_Kong/156/97 14,2 14,8 15,1 14,7 13,8 14,4 13,2 13,0 13,8 13,3 12,2 1,1 6,9
13 A/goose/Vietnam/3/05 13,0 13,4 13,7 13,3 12,3 13,0 11,9 11,4 12,3 11,7 10,9 1,8 6,9
14 A/Goose/Guangdong/1/96 5,2 5,6 5,9 5,5 4,3 5,3 5,0 3,0 3,6 3,3 3,2 11,1 9,8
Nucleotide (%)
Sự sai khác di truyền của các chủng virus cúm thuộc clade 7 mà chúng tôi thu thập ở Việt Nam so với chủng virus ủược coi là thủy tổ của virus cỳm A/H5N1 ủộc lực cao (A/Goose/Guangdong/1/96) là 4,3 – 5,9% ở mức ủộ nucleotide và 4,1 – 5,8% ở mức ủộ axit amin.