CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3. Xỏc ủịnh một số ủặc tớnh sinh học của virus A/H5N1 clade 7 phõn lập ở Việt Nam (A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008)
3.3.1. Tớnh thớch ứng trờn phụi gà (xỏc ủịnh chỉ số EID 50 )
Virus cỳm núi chung và virus cỳm gia cầm A/H5N1 ủộc lực cao cú khả năng phỏt triển tốt trờn phụi gà, vỡ vậy phụi gà 9-10 ngày tuổi thường ủược sử dụng để phân lập virus cúm gia cầm độc lực cao trong cơng tác chẩn đốn cũng như ủể giữ giống virus. Tuy nhiờn, cỏc chủng virus cỳm gia cầm cú ủặc ủiểm khác nhau khi nhân lên trên phôi trứng, thể hiện bằng sự gây nhiễm phôi, gây chết phụi và chuẩn ủộ tối ưu của virus khi nhõn lờn trờn phụi trứng. Sự khỏc biệt về thời gian gõy chết phụi trứng và chuẩn ủộ tối ưu của cỏc chủng virus khỏc nhau là khỏc nhau. Virus cú ủộc lực thấp thường giết chết phụi trứng chậm hơn và cú thể thu ủược virus với nồng ủộ cao hơn so với virus cỳm cú ủộc lực cao và ngược lại.
ðể xỏc ủịnh tớnh thớch ứng của cỏc chủng virus cỳm gia cầm H5N1 clade 7 phõn lập ủược, chỳng tụi lựa chọn chủng A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 làm chủng ủại diện vỡ chủng này cú thể ủược coi là gần với chủng gốc thuộc clade 7 có từ Trung Quốc.
Phụi trứng ủược lấy từ ủàn gà khỏe mạnh chưa tiờm vacxin cỳm gia cầm H5N1, và khụng nhiễm virus cỳm gia cầm trong tự nhiờn ủể trỏnh tỏc ủộng nếu cú (trong lũng ủỏ của phụi trứng) của khỏng thể từ gà mẹ ủược tiờm phũng.
Trứng ủược mua từ lỳc 8 ngày tuổi và ấp tiếp 1 ngày ủể ổn ủịnh tại phũng thớ nghiệm trước khi sử dụng cho thớ nghiệm xỏc ủịnh sự thớch nghi của chủng virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 trên phôi gà.
Chủng virus cỳm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 ủó ủược chia thành nhiều ống nhỏ sau khi phõn lập và giữ ở nhiệt ủộ -860C. Trước khi tiến hành thớ nghiệm hỗn dịch virus ủó ủược kiểm tra vụ trựng theo thường quy và ủược pha thành nhiều nồng ủộ từ 10-1 ủến 10-8 bằng dung dịch ủệm PBS cú pH 7,2. Tiến hành gõy nhiễm cho phụi trứng với 6 nồng ủộ pha loóng từ 10-3 ủến 10-8 vào xoang niệu mụ (allantoic cavity) của phụi trứng, mỗi nồng ủộ gõy nhiễm cho 5 phụi với liều 100àl/phụi, ấp tiếp ở nhiệt ủộ 370C, theo dừi 2 lần/ngày cỏch nhau
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
85
khoảng 8 giờ trong vòng 4 ngày, loại phôi chết trước 24 giờ. Trong thí nghiệm này cú sử dụng 3 phụi trứng tiờm dung dịch PBS làm ủối chứng õm và ấp trong cựng ủiều kiện.
Cỏc phụi trứng chết trong thời gian theo dừi ủược làm lạnh ở nhiệt ủộ 2 – 80C trong vòng 24 giờ cho mạch máu có lại và tiến hành mổ trứng thu hoạch dịch niệu mụ. Những phụi trứng sống sau thời gian theo dừi (kể cả ủối chứng õm tớnh) ủều ủược thua dịch niệu mụ và ủược kiểm tra bằng phản ứng HA ủể xỏc ủịnh khả năng nhiễm của virus trờn phụi trứng và xỏc ủịnh chỉ số EID50 theo cụng thức Reed-Muench.
Trước khi gõy nhiễm chỳng tụi ủó tiến hành kiểm tra vụ trựng cỏc ống virus giống trên các môi trường: nước thịt, BHI, thạch thường, thạch máu, Sabauraud và nước thịt gan yếm khớ, nhằm mục ủớch xỏc ủịnh chắc chắn phụi trứng chết là do virus cúm gây ra. Chúng tôi kiểm tra phôi trứng hàng ngày 2 lần, cỏch nhau 8h ủể ghi nhận chi tiết về thời gian chết của phụi. Kết quả thời gian gây chết phôi trình bày ở bảng 3.9.
Kết quả xỏc ủịnh khả năng gõy nhiễm trờn phụi gà và chỉ số EID50 của chủng virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 ủược trỡnh bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.9. Theo dõi thời gian gây chết phôi ðợt
TN
Số phôi gây nhiễm
Theo dõi số phôi chết Tổng số phôi chết
Tỷ lệ 0-24 h 25-48 h 49-72 h 73-96h (%)
1 30 0 10 5 5 20 67
2 30 0 10 5 4 19 63
3 30 0 10 5 4 19 63
Kết quả cho thấy: khụng cú phụi chết trước 24 giờ, virus bắt ủầu giết chết phôi trong vòng 2 ngày từ sau khi gây nhiễm. ðiều này cũng phù hợp với các ghi nhận thường nhật khi chúng tôi tiến hành phân lập các mẫu có virus cúm gia cầm H5N1 trờn phụi trứng, và cũng phự hợp với cỏc nghiờn cứu trước ủõy (Easterday
và cs, 1997; Wanasawaeng và cs, 2009) nhận xột rằng virus cỳm ủộc lực cao thường giết chết phôi trứng trong vòng 48 giờ sau khi gây nhiễm (h.p.i – hour post-infection) lên xoang niệu mô.
Bảng 3.10. Kết quả theo dõi tỷ lệ sống/chết của phôi trứng khi gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 Lần thí
nghiệm
Hiệu giá pha loãng
Số phôi gây nhiễm
Số phôi bị nhiễm
Số phôi không nhiễm
Số tích lũy Tỷ lệ nhiễm virus (%) A/(A+B) × 100 Nhiễm
virus (A)
Không nhiễm (B)
Tổng cộng (A+B)
Lần 1
10-3 5 5 0 20 0 20 100
10-4 5 5 0 15 0 15 100
10-5 5 5 0 10 0 10 100
10-6 5 4 1 5 1 6 83.3
10-7 5 1 4 1 5 6 16.7
10-8 5 0 5 0 10 10 0
ðC (-) 3 0 3
EID50/0,1ml 107 (theo công thức Reed-Muench)
Lần 2
10-3 5 5 0 19 0 19 100
10-4 5 5 0 14 0 14 100
10-5 5 5 0 9 0 9 100
10-6 5 3 2 4 1 5 80.0
10-7 5 1 4 1 5 6 16.7
10-8 5 0 5 0 10 10 0
ðC (-) 3 0 3
EID50/0,1 ml 106.9 (theo công thức Reed-Muench)
Lần 3
10-3 5 5 0 19 0 19 100
10-4 5 5 0 14 0 14 100
10-5 5 5 0 9 0 9 100
10-6 5 3 2 4 1 5 80.0
10-7 5 1 4 1 5 6 16.7
10-8 5 0 5 0 10 10 0
ðC (-) 3 0 3 0
EID50/0,1 ml 106.9 (theo công thức Reed-Muench)
- Ở nồng ủộ pha loóng 10-3, toàn bộ phụi trứng chết trong vũng 40h sau khi gây nhiễm.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà N
- Ở nồng ủộ 10-4 khoảng 40-48 giờ sau khi nhi
- Nồng ủộ 10-5 cũng gi hơn so với nồng ủộ 10-3 và
- Ở nồng ủộ 10-6 1 -2 phôi v - Nồng ủộ pha loóng cao nh
1/5 phụi chết ở thời ủiểm 96h , và 4 phụi v nhất là 10-8, toàn bộ số phôi tr
-
1 - 10
107,9EID50/ml.
Hình 3.6. Kiểm tra ðể xỏc ủịnh kh A/Chicken/Vietnam/NCVD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
p Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp 4 toàn bộ số phôi trứng chết trong ngày th sau khi nhiễm.
ũng giết chết toàn bộ phôi trứng nhưng trong th và10-4, nhưng cũng không quá 72h kể từ khi gây nhi
ế -
2 phôi vẫn còn sống (tùy theo lần thí nghiệm khác nhau).
pha loãng cao nhất gây chết phôi trứng là 10-7, tuy nhiên ch m 96h , và 4 phụi vẫn cũn sống. Ở nồng ủộ pha loóng cao phụi trứng ủều sống bỡnh thường.
.
/chicken/ -
107EID50 2 – 106,9EID50 3 – 106,9EID
ủặc tớnh gõy ngưng kết hồng cầ
nh khả năng gây nhiễm phôi trứng c
A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008, chúng tôi thu dịch niệu mô (allantoic 3 4 5 6 7 8 9 10 11
t trong ngày thứ hai, trong
ng nhưng trong thời gian lâu khi gây nhiễm.
m khác nhau).
, tuy nhiên chỉ có pha loãng cao
.
EID50
) ng của virus u mô (allantoic
11 12
fluid) của toàn bộ số phôi ch
cầu (HA) với hồng cầu gà (xem hình 3.6).
Kết quả cho thấy ch khả năng gây ngưng kết h ủạt từ 8-9log2. Kết quả này c
ự (2009) (Wanasawaeng và cs, 2009) khi nghiên c A/H5N1 của Thái Lan (ký hi
Dịch niêu mô thu th 10-6 và 10-7) không có kh vậy cú thể nhận ủịnh rằ Dose) cũng chính là liều gây ch
Phôi nhiễm virus
Hình 3.7. Bệnh tích phôi sau khi gây
Bên cạnh việc kiể hành mổ trứng, thu phụi ủ ủều cú triệu chứng xuất huy
48giờ 72gi
phụi chết và phụi sống và kiểm tra ủặc tớnh ngưng k u gà (xem hình 3.6).
y chỉ có dịch niêu mô thu thập từ phôi trứng ch t hồng cầu gà, với hiệu giá HA của dịch niệu mô thư
này cũng tương tự với nghiên cứu của Wanasa (2009) (Wanasawaeng và cs, 2009) khi nghiên cứu một chủ
a Thái Lan (ký hiệu C2105Dx1) phân lập năm 2004.
ch niêu mô thu thập từ phôi trứng sống (kể cả phôi sống ở
) không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà (Xem hình 3.6). Vì ằng liều gây nhiễm phôi trứng gà (EID-Egg Infectious u gây chết phôi (ELD-Egg Lethal Dose).
m virus Phụi ủối chứng
nh tích phôi sau khi gây
ểm tra ủặc tớnh ngưng kết hồng cầu, chỳng tụi c ng, thu phụi ủể kiểm tra bệnh tớch phụi. Toàn bộ số phụi tr
t huyết lan tràn, phụi cũi cọc, phỏt triển kộm. Phụi ủ
giờ ðối chứng
c tính ngưng kết hồng
ng chết mới có u mô thường a Wanasa
cỏc nồng ủộ u gà (Xem hình 3.6). Vì Egg Infectious
ng
u, chúng tôi cũng tiến phôi trứng chết n kộm. Phụi ủối
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp
89
chứng phát triển bình thường (xem hình 3.7). Kết quả của thí nghiệm này cho thấy virus cúm A/H5N1clade 7 - A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 có khả năng thớch ứng tốt trờn phụi trứng gà và ủạt ủược hiệu giỏ tối ưu trung bỡnh là 107,9EID50/ml (106.9-107,0 EID50/0,1ml (bảng 3.10).