1.2.8. Sự ức chế PPO
1.2.8.2. Phương pháp hóa học
Phương pháp hóa học thường được sử dụng phổ biến trong ức chế enzyme hóa nâu.
Tuy nhiên việc sử dụng hóa chất trong chế biến sản phẩm thực phẩm yêu cầu phải không độc và không ảnh hưởng bất lợi đến mùi vị của sản phẩm. [30] * Ức chế hóa học enzyme
Ức chế hóa học enzyme là sự tác động trực tiếp của chất hóa học lên enzyme và được phân thành hai nhóm : nhóm thứ nhất tương tác với đồng và nhóm thứ hai ảnh hưởng đến vị trí tương tác của enzyme với cơ chất phenolic.
Trong nhóm thứ nhất, ức chế bởi tác nhân kìm kẹp ion đồng như acid, cyanide, cacbon monoxide được thử nghiệm trên hoạt tính của PPO từ nhiều nguồn khác nhau (Healey and Strothkamp, 1981 ; Zawistowski et al., 1988). Tương tự, ức chế PPO bởi ion halogen vô cơ được thử nghiệm trên hoạt tính PPO trong táo (Janovitz-Klapp et al., 1990).
Trong chất ức chế thuộc nhóm thứ 2, acid cacboxylic vòng thơm của benzoic, cinnanic được nghiên cứu rộng rãi, chúng hoạt động như chất ức chế cạnh tranh của PPO bởi vì cấu trúc của chúng tương tự cơ chất phenolic. [30] * Tác nhân khử Phương pháp phổ biến nhất trong ức chế enzyme hóa nâu trong công nghiệp và thí nghiệm là sử dụng tác nhân khử như acid ascorbic, hợp chất thiol, sulfite và amino acid. Phức hợp khử ngăn chặn sự hóa nâu bởi sự khử o-quinon nội sinh thành o- diphenol ban đầu hoặc bất hoạt không thuận nghịch PPO. Tuy nhiên hiệu quả của tác nhân khử giảm đáng kể nếu sử dụng chúng sau khi phản ứng enzyme đã bắt đầu.[30]
Acid ascorbic và dẫn xuất của nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để ức chế enzyme hóa nâu. Trong hệ thống thực phẩm, chúng hoạt động như các gốc tự do và khử o-quinon thành diphenol. Trong hệ thống sinh học, acid ascorbic ức chế sự hóa nâu trong dịch chiết quả lê, trong táo acid ascorbic – di-photphat và tri- photphat ức chế mạnh enzyme hóa nâu trên mặt cắt của táo. Acid erythorbic có cấu trúc rất giống với acid ascorbic nên cũng được sử dụng trong sản xuất thực phẩm để ức chế hiện tượng hóa nâu, tuy nhiên chúng thường được sử dụng trong thực phẩm dạng lỏng. [54]
Sulfite ức chế hiệu quả sự hóa nâu trong sản phẩm thực phẩm nhưng sulfite ảnh hưởng có hại đến sức khỏe như bệnh hen suyễn, do đó chúng bị giới hạn hay cấm sử dụng ở một số nước. Một vài nghiên cứu được thực hiện trên amino acid chứa sulfhydryl như cystein và dẫn xuất của cystein như cystein methyl ester, glutathione được chứng minh là ức chế hiệu quả sự hóa nâu. [30]
Sodium chloride là tác nhân oxi hóa mạnh, có thể tạo ra chlorine dioxide trong điều kiện acid ức chế hoạt động của PPO. [22]
* Tác nhân kìm kẹp
PPO là một metalloenzym chứa đồng, ion đồng là thành phần quan trọng của phản ứng enzyme, PPO bị ức chế bởi tác nhân kìm kẹp. Cystein có thể phản ứng với đồng tại trung tâm hoạt động của enzyme và trực tiếp ức chế enzyme. [54]
Dẫn xuất photphat và EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) liên kết với đồng tại trung tâm hoạt động của PPO hoặc giảm mức độ hiệu quả của sự hợp nhất
đồng trong holoenzyme, tuy nhiên chúng chỉ có khả năng làm chậm phản ứng của enzyme nhưng không hoàn toàn ức chế enzyme [30]
EDTA là phức hợp được biết nhiều nhất và sử dụng làm giảm sự hóa đen sau khi nấu tinh bột khoai tây, trong khi Sporix một sản phẩm acidic polyphosphat là tác nhân ức chế mạnh và rất hiệu quả trong ngăn chặn enzyme hóa nâu trong nước táo [30]
* Tác nhân pH
Hoạt tính tối ưu của enzyme phụ thuộc vào pH, sự thay đổi pH của môi trường làm giảm hoạt tính của PPO. pH tối ưu cho hoạt động của PPO phụ thuộc vào nguồn enzyme và cơ chất, trong nhiều trường hợp pH tối ưu nằm trong khoảng 6 đến 7. PPO bị bất hoạt hiệu quả trong dung dịch có pH thấp hơn 3. Phức hợp chính làm giảm hoạt động của PPO gồm acid hữu cơ như acid malic, tartaric, malonic và acid vô cơ như phosphoric và hydrochloric acid, acid acetic trong sản phẩm giấm [30]. Acid citric ức chế enzyme hóa nâu vì nó hoạt động như tác nhân kìm kẹp để loại bỏ đồng ở trung tâm hoạt động và nó cũng là phức hợp acid làm giảm pH của hỗn hợp. [54]
* Tác nhân phức hợp
Một phương pháp khác để loại bỏ hợp chất phenolic trong thực phẩm dạng lỏng là sử dụng cyclodextrin, đặc biệt β-cyclodextrin, ức chế hiệu quả sự hóa nâu trong nước táo, đặc tính quan trọng nhất của cyclodextrin là khả năng hình thành phức hợp với các phân tử hữu cơ kể cả cơ chất của PPO [22]. PVPP (polyvinylpolypyrollidone) là sản phẩm cho phép sử dụng để ức chế sự hóa nâu trong nước táo. Polysacharide sulphat như carrageenan ức chế hóa nâu trong nước táo, táo cắt lát và hiệu quả ức chế của chúng tăng lên với sự hiện diện của 0,5% acid citric. [30, 54]
* Các chất khác
Một vài chất ức chế tự nhiên như protein, peptit và amino acid đã được nghiên cứu.
Cyclotetrapeptit tiết ra từ Lactobaccilus helveticus có khả năng ức chế hoạt động của
mở ra khả năng mới trong việc ứng dụng các peptit này trong thực phẩm vừa có khả năng ức chế PPO vừa làm tăng hàm lượng protein trong khẩu phần của con người.
[54] 1.2.8.3. Phương pháp enzyme
Enzyme có bản chất cấu tạo là protein vì vậy có thể bị tấn công và bất hoạt bởi enzyme khác có khả năng phân giải phần protein của enzyme. Sự ức chế enzyme hóa nâu trong kiwi cắt và bột kiwi khi tiếp xúc với actinidin, một protease hoạt tính cao (Labuza et al., 1990). Ba protease thực vật khác gồm ficin từ sung, papain từ đu đủ và bromelin từ thơm được chứng minh là hiệu quả trong điều khiển enzyme hóa nâu mà đặc biệt là enzyme ficin có tác động mạnh hơn. [30]
Những enzyme khác ngăn chặn sự hóa nâu bởi việc loại bỏ cơ chất phenolic bằng sự cải biến hóa học. Sử dụng o-methyltransferase để methyl hóa o-dihydroxy phenolic thành dẫn xuất methoxy tương ứng. Kelly và Finkle xử lý nước táo với enzym protocatechuate 3,4-dioxygenase từ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa xúc tác phản ứng oxi hóa mở vòng và phân đôi ortho của catechol, nước táo có xử lý enzyme không bị đen khi so sánh với mẫu đối chứng không xử lý. Tuy nhiên việc xử lý enzyme ngăn chặn sự hóa nâu có giá thành cao và không thích hợp ứng dụng trong sản xuất thương mại. [30]
1.2.8.4. Phương pháp gen
Công nghệ sinh học phân tử mở ra triển vọng điều khiển sự biểu hiện của PPO thông qua điều khiển sản xuất các protein bên trong tế bào, qua thao tác gen có thể sử dụng ức chế PPO trong cây chuyển gen bởi sự biểu hiện PPO trong định hướng antisense.
Sự biểu hiện của PPO trong khoai tây giảm bởi sử dụng vector mang antisense PPO cDNA. [30, 47].
1.2.9. Cơ chất của polyphenol oxidase : Phenol
Phenol là hợp chất có vòng thơm có nhóm hydroxyl gắn trực tiếp vào vòng benzen hay vòng bezonoid. Sự hiện diện của các nhóm hydroxyl ảnh hưởng đến tính chất vật lý của phenol. Các nhóm hydroxyl này hình thành liên kết hidro với các phenol khác và với nước, do đó phenol có nhiệt độ sôi cao và hòa tan trong nước tốt hơn các hydrocacbon có cùng trọng lượng phân tử. [10,41]
Dựa vào đặc trưng của khung cacbon các hợp chất phenol được chia thành 3 nhóm chính : nhóm hợp chất phenol C6 – C1 (axit malic), nhóm hợp chất phenol C6 – C3 (axit cafeic) và nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6 (catechin và flavonoit). Khả năng phản ứng tạo màu mạnh hay yếu phụ thuộc vào cấu trúc của phenol cũng như nguồn enzyme xúc tác phản ứng oxi hóa các phenol này. Các polyphenol có chứa gốc pyrocatechin hoặc pyrogalic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxi hóa – khử, phản ứng cộng và phản ứng ngưng tụ[10]. Một số hợp chất polyphenol phổ biến trong tự nhiên được thể hiện trong hình 1.8
Hình 1.8. Cấu trúc của vài hợp chất polyphenol trong tự nhiên [10]
Polyphenol là hợp chất phổ biến ở thực vật, có vai trò quan trọng trong chuyển hóa ở thực vật, tạo hệ thống phòng vệ chống kẻ thù, hình thành màu sắc rực rỡ ở nhiều loại trái cây và rau củ, ngăn chặn nẩy mầm sớm ở hạt giống. Những nghiên cứu gần đây đang tập trung vào phenolic thực vật là flavonoid có đặc tính chống oxi hóa bởi loại các gốc tự do và phản ứng với oxi hình thành trong quá trình trao đổi chất.
Flavonoid còn có vai trò làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch, ức chế oxi hóa cholesteron