- Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, giai đoạn chuẩn bị cần loại bỏ lignin từ mô gỗ và tẩy trắng bột giấy. Thông thường bột giấy được tẩy trắng bằng tác nhân chlorine hoặc oxi hóa dựa trên sự oxi hóa hóa học tuy nhiên những tác nhân này thường gây ô nhiễm độc hại cho môi trường. Ứng dụng laccase trong xử lý lignin và tẩy trắng sinh học đã đem lại một chiến lược sản xuất sạch, an toàn hơn và không làm thay đổi tính chất của cellulose [11,41,53]. Laccase có thể phân hủy lignin trong bột giấy khi được sử dụng cùng với các mediator (một phức hợp nhỏ trọng lượng phân tử thấp với điện thế khử cao). Mediator bị oxi hóa bởi laccase và phân tử mediator bị oxi hóa sẽ tiếp tục oxi hóa tiểu đơn vị của lignin (lignin không phải là cơ chất của laccase nhưng nhờ các mediator nó trở thành cơ chất gián tiếp của laccase). Ngoài ra laccase còn được sử dụng để loại mực và tẩy trắng giấy in, sử dụng để liên kết các cấu tử gỗ trong sản xuất tấm sợi ép, ván ép,….[12]
- Trong công nghiệp dệt may laccase được sử dụng để cải tiến độ trắng trong tẩy trắng bông, vải với ưu điểm là tiết kiệm hóa chất, năng lượng và nước. Laccase có thể sử dụng để chuyển đổi tiền chất của thuốc nhuộm để nhuộm vải tốt hơn và hiệu quả hơn. Laccase có thể sử dụng để tẩy mùi hôi trên vải, bề mặt sofa, màn
- Gần đây, laccase còn được ứng dụng như là chất xúc tác sinh học mới trong tổng hợp chất hữu cơ. Laccase xúc tác phản ứng liên kết của các chất tương tự urushiol để tạo “urushi nhân tạo” (một loại sơn truyền thống của Nhật Bản). Trong một số nghiên cứu laccacse có khả năng trùng hợp các hợp chất amino, phenolic và các gốc tự do của acrylamide khi có hoặc không có mediator. Ngoài ra laccase còn được sử dụng để tổng hợp các chất hữu cơ có chức năng như các polyme phục vụ cho cơ khí, điện, quang học, thuốc nhuộm, màu mỹ phẩm, thuốc trừ sâu.[12]
1.2.7.3. Trong công nghệ môi trƣờng
Sự hiện diện các hợp chất phenolic và dẫn xuất của chúng có tính chất độc hại trong nước thải công nghiệp từ công nghệ chuyển hóa than, lọc dầu, bảo quản gỗ, công nghiệp dệt, giấy, thực phẩm, hóa chất là vấn đề rất lớn hiện nay. Quy định của pháp luật rất nghiêm ngặt ở những nước phát triển về việc loại bỏ các chất độc hại khỏi nước thải trước khi chúng được thải ra môi trường. Sự quan tâm gần đây tập trung vào sử dụng peroxidase và PPO trong việc loại bỏ hợp chất phenolic từ nước thải công nghiệp. Laccase cố định có khả năng loại bỏ các chất ô nhiễm phenol và chlorophenol. [11, 41]
1.2.7.4. Trong y học và mỹ phẩm
- Trong y học, theo những nghiên cứu gần đây cho thấy PPO có khả năng ức chế sự bám dính của Streptococcus sobrinu, vi khuẩn gây hư hỏng răng. PPO được sử dụng trong điều trị bệnh Parkinson do PPO xúc tác phản ứng chuyển đổi L-tyrosine thành L-DOPA cung cấp đủ lượng dopamine cho bệnh nhân mắc bệnh Parkinson. PPO được sử dụng trong ứng dụng lâm sàng như là dấu hiệu của bệnh đốm bạch tạng, bệnh tự miễn dịch, ức chế khối u. [41]
Laccase được sử dụng để tổng hợp các hợp chất phức tạp trong y tế như thuốc gây mê, kháng viêm, thuốc an thần, kháng sinh…Ngoài ra, hệ thống laccase mediator sử dụng để xác định kháng thể đơn dòng của azelic acid từ oleic acid, Laccase có khả năng ức chế hoạt động phiên mã ngược của HIV-1. Một laccase được chứng minh là có khả năng chống lại chứng aceruloplasminemia (một rối loạn do sắt tích tụ dần trong não hay cơ quan khác do thiếu ceruloplasmin – một ferroxidase hoạt động điều hòa
nội cân bằng sắt). Một phương pháp enzyme mới sử dụng laccase để phát hiện đồng thời cocain và morphine trong các mẫu thuốc.[12]
- Lĩnh vực ứng dụng mới của laccase là trong mỹ phẩm. Thuốc nhuộm tóc chứa laccase ít gây kích thích và dễ sử dụng hơn thuốc nhuộm tóc hiện tại. Gần đây các chế phẩm mỹ phẩm và sản phẩm chăm sóc da có chứa protein laccase làm cho da sáng cũng được phát triển. Laccase được sử dụng trong sản phẩm vệ sinh cá nhân gồm kem đáng răng, nước súc miệng, chất tẩy rửa, xà phòng, khăn vệ sinh,….[12]
1.2.7.5. Trong công nghệ sinh học nano
Khoa học Nano phát triển rất nhanh trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung vào ứng dụng công nghệ nano bởi vì công nghệ nano ảnh hưởng đến tất cả các lĩnh vực của hoạt động con người (môi trường, kinh tế, công nghiệp, điều trị bệnh, …). Vật liệu nano được sử dụng rộng rãi như vật liệu mang trong cảm biến sinh học (biosensor) và pin sinh học (biofuel cell) [12]
Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng đầu dò sinh học – thành phần kết hợp với một bộ chuyển đổi điện tử, do đó chuyển đổi một tín hiệu sinh hóa thành tín hiệu điện có thể nhận biết, truyền tải và ghi nhận thông tin liên quan đến những thay đổi sinh lí hoặc sinh hóa. Một cảm biến sinh học chứa laccase được phát triển trong phương pháp miễn dịch, xác định glucose, amine thơm, hợp chất phenolic.[12]
Ngoài ra laccase có thể được giữ cố định trên cực âm của pin sinh học, là một enzyme oxi hóa laccase có khả năng chuyển bốn điện tử đến oxi tạo nước thông qua quá trình oxi hóa các hợp chất phenolic và chất thơm, có tiềm năng ứng dụng trong các tế bào nhiên liệu sinh học để sản xuất điện thông qua phản ứng hóa học.
[12]
1.2.8. Sự ức chế PPO
Sự hóa nâu do tác động của PPO làm ảnh hưởng lớn đến chất lượng thực phẩm, làm giảm giá trị kinh tế của nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là trái cây tươi như táo, lê, chuối, nho, táo tây và rau củ như rau diếp, nấm rơm, khoai tây,…, và hải sản như tôm,
chấp nhận của người tiêu dùng (do sự thay đổi màu sắc, mùi vị, độ mềm và giá trị dinh dưỡng) đối với trái cây và rau củ bị hóa nâu. [30]
Ức chế PPO gây hiện tượng hóa nâu trong phần lớn các sản phẩm thực phẩm tươi là mục tiêu của nhiều ngành công nghiệp thực phẩm. Có nhiều phương pháp để ức chế enzyme hóa nâu, tuy nhiên việc lựa chọn phương pháp phù hợp tùy thuộc vào nguồn gốc của PPO, rút ngắn quy trình sản xuất, phụ thuộc vào giá thành của phương pháp và sự chấp nhận của người tiêu dùng đối với phương pháp lựa chọn.
[54]
1.2.8.1. Phƣơng pháp vật lý * Ảnh hƣởng của nhiệt độ
- Nhiệt độ lạnh (0 – dưới 10oC) làm giảm hoạt động của enzyme hóa nâu, tuy nhiên sự thay đổi màu vẫn xảy ra ở nhiệt độ lạnh và sản phẩm dễ bị hỏng do sự tạo thành các tinh thể đá. Trong điều kiện lạnh hoạt động enzyme hóa nâu bị ức chế hoàn toàn khi lưu giữ ở nhiệt độ khoảng - 18 oC. [30]
- Xử lý ở nhiệt độ cao là phương pháp thường sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để ngăn cản sự hư hỏng của thực phẩm với mục tiêu làm giảm hoạt tính của enzyme bởi sự bất hoạt không thuận nghịch enzyme và giảm sự nhiễm khuẩn. Xử lý nhiệt độ cao là phương pháp dễ sử dụng để ức chế enzyme hóa nâu trong rau quả, trái cây, tôm, tôm hùm, ….Tuy nhiên, thời gian và nhiệt độ xử lý phải phù hợp với tính chất của sản phẩm. Những bất lợi của xử lý nhiệt là hình thành mùi và màu không mong muốn do phản ứng Maillard.[54]
- Phương pháp xử lý nhiệt kết hợp với sóng siêu âm cũng được sử dụng để ức chế PPO. Ưu điểm của phương pháp này là giảm nhiệt độ xử lý, thường được ứng dụng để xử lý các sản phẩm nhạy cảm với nhiệt. [54]
*Sử dụng carbon dioxide siêu tới hạn
Carbon dioxide siêu tới hạn được ứng dụng để bất hoạt PPO trong vỏ khoai tây, tôm, tôm hùm,….Xử lý enzyme với CO2 áp suất cao (58 atm) trong 30 phút làm giảm 91% hoạt tính của PPO . [30]
*Bảo quản tránh oxi
Loại bỏ hoàn toàn oxi là con đường thích hợp nhất để ức chế sự oxi hóa hợp chất phenol xúc tác bởi PPO, phương pháp này được ứng dụng cho mô chết do việc tạo thành hàng rào bảo vệ tự nhiên ngăn cản sự khuếch tán của oxi như ngâm trái cây trong siro đường, sử dụng màng bao không thấm nước hoặc sử dụng khí trơ như chân không hay không khí nghèo oxi. [30]
*Chiếu xạ
Trái cây và rau củ có thể xử lý bởi chiếu xạ tia γ để kéo dài thời gian bảo quản. Chiếu xạ tiêu diệt vi sinh vật và kiềm chế quá trình chín và lão hóa của trái cây và rau quả. Liu và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ trên cần tây cho thấy sự giảm 73% hoạt tính của PPO trong mẫu xử lý với 1,0 KGy sau 3 ngày bảo quản ở 4oC. Sau 9 ngày enzyme thể hiện hoạt tính khoảng 25% thấp hơn mẫu đối chứng. Có thể sử dụng kết hợp chiếu xạ liều thấp với xử lý hóa chất (calcium ascorbate và acid ascorbic) hay các phương pháp khác để ức chế sự hóa nâu. [22]
1.2.8.2. Phƣơng pháp hóa học
Phương pháp hóa học thường được sử dụng phổ biến trong ức chế enzyme hóa nâu. Tuy nhiên việc sử dụng hóa chất trong chế biến sản phẩm thực phẩm yêu cầu phải không độc và không ảnh hưởng bất lợi đến mùi vị của sản phẩm. [30] * Ức chế hóa học enzyme
Ức chế hóa học enzyme là sự tác động trực tiếp của chất hóa học lên enzyme và được phân thành hai nhóm : nhóm thứ nhất tương tác với đồng và nhóm thứ hai ảnh hưởng đến vị trí tương tác của enzyme với cơ chất phenolic.
Trong nhóm thứ nhất, ức chế bởi tác nhân kìm kẹp ion đồng như acid, cyanide, cacbon monoxide được thử nghiệm trên hoạt tính của PPO từ nhiều nguồn khác nhau (Healey and Strothkamp, 1981 ; Zawistowski et al., 1988). Tương tự, ức chế PPO bởi ion halogen vô cơ được thử nghiệm trên hoạt tính PPO trong táo (Janovitz-Klapp et al., 1990).
Trong chất ức chế thuộc nhóm thứ 2, acid cacboxylic vòng thơm của benzoic, cinnanic được nghiên cứu rộng rãi, chúng hoạt động như chất ức chế cạnh tranh của PPO bởi vì cấu trúc của chúng tương tự cơ chất phenolic. [30] * Tác nhân khử
Phương pháp phổ biến nhất trong ức chế enzyme hóa nâu trong công nghiệp và thí nghiệm là sử dụng tác nhân khử như acid ascorbic, hợp chất thiol, sulfite và amino acid. Phức hợp khử ngăn chặn sự hóa nâu bởi sự khử o-quinon nội sinh thành o- diphenol ban đầu hoặc bất hoạt không thuận nghịch PPO. Tuy nhiên hiệu quả của tác nhân khử giảm đáng kể nếu sử dụng chúng sau khi phản ứng enzyme đã bắt đầu.[30] Acid ascorbic và dẫn xuất của nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để ức chế enzyme hóa nâu. Trong hệ thống thực phẩm, chúng hoạt động như các gốc tự do và khử o-quinon thành diphenol. Trong hệ thống sinh học, acid ascorbic ức chế sự hóa nâu trong dịch chiết quả lê, trong táo acid ascorbic – di-photphat và tri- photphat ức chế mạnh enzyme hóa nâu trên mặt cắt của táo. Acid erythorbic có cấu trúc rất giống với acid ascorbic nên cũng được sử dụng trong sản xuất thực phẩm để ức chế hiện tượng hóa nâu, tuy nhiên chúng thường được sử dụng trong thực phẩm dạng lỏng. [54]
Sulfite ức chế hiệu quả sự hóa nâu trong sản phẩm thực phẩm nhưng sulfite ảnh hưởng có hại đến sức khỏe như bệnh hen suyễn, do đó chúng bị giới hạn hay cấm sử dụng ở một số nước. Một vài nghiên cứu được thực hiện trên amino acid chứa sulfhydryl như cystein và dẫn xuất của cystein như cystein methyl ester, glutathione được chứng minh là ức chế hiệu quả sự hóa nâu. [30]
Sodium chloride là tác nhân oxi hóa mạnh, có thể tạo ra chlorine dioxide trong điều kiện acid ức chế hoạt động của PPO. [22]
*Tác nhân kìm kẹp
PPO là một metalloenzym chứa đồng, ion đồng là thành phần quan trọng của phản ứng enzyme, PPO bị ức chế bởi tác nhân kìm kẹp. Cystein có thể phản ứng với đồng tại trung tâm hoạt động của enzyme và trực tiếp ức chế enzyme. [54]
Dẫn xuất photphat và EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) liên kết với đồng tại trung tâm hoạt động của PPO hoặc giảm mức độ hiệu quả của sự hợp nhất
đồng trong holoenzyme, tuy nhiên chúng chỉ có khả năng làm chậm phản ứng của enzyme nhưng không hoàn toàn ức chế enzyme [30]
EDTA là phức hợp được biết nhiều nhất và sử dụng làm giảm sự hóa đen sau khi nấu tinh bột khoai tây, trong khi Sporix một sản phẩm acidic polyphosphat là tác nhân ức chế mạnh và rất hiệu quả trong ngăn chặn enzyme hóa nâu trong nước táo [30]
*Tác nhân pH
Hoạt tính tối ưu của enzyme phụ thuộc vào pH, sự thay đổi pH của môi trường làm giảm hoạt tính của PPO. pH tối ưu cho hoạt động của PPO phụ thuộc vào nguồn enzyme và cơ chất, trong nhiều trường hợp pH tối ưu nằm trong khoảng 6 đến 7. PPO bị bất hoạt hiệu quả trong dung dịch có pH thấp hơn 3. Phức hợp chính làm giảm hoạt động của PPO gồm acid hữu cơ như acid malic, tartaric, malonic và acid vô cơ như phosphoric và hydrochloric acid, acid acetic trong sản phẩm giấm [30]. Acid citric ức chế enzyme hóa nâu vì nó hoạt động như tác nhân kìm kẹp để loại bỏ đồng ở trung tâm hoạt động và nó cũng là phức hợp acid làm giảm pH của hỗn hợp. [54]
*Tác nhân phức hợp
Một phương pháp khác để loại bỏ hợp chất phenolic trong thực phẩm dạng lỏng là sử dụng cyclodextrin, đặc biệt β-cyclodextrin, ức chế hiệu quả sự hóa nâu trong nước táo, đặc tính quan trọng nhất của cyclodextrin là khả năng hình thành phức hợp với các phân tử hữu cơ kể cả cơ chất của PPO [22]. PVPP (polyvinylpolypyrollidone) là sản phẩm cho phép sử dụng để ức chế sự hóa nâu trong nước táo. Polysacharide sulphat như carrageenan ức chế hóa nâu trong nước táo, táo cắt lát và hiệu quả ức chế của chúng tăng lên với sự hiện diện của 0,5% acid citric. [30, 54]
*Các chất khác
Một vài chất ức chế tự nhiên như protein, peptit và amino acid đã được nghiên cứu. Cyclotetrapeptit tiết ra từ Lactobaccilus helveticus có khả năng ức chế hoạt động của
mở ra khả năng mới trong việc ứng dụng các peptit này trong thực phẩm vừa có khả năng ức chế PPO vừa làm tăng hàm lượng protein trong khẩu phần của con người. [54] 1.2.8.3. Phƣơng pháp enzyme
Enzyme có bản chất cấu tạo là protein vì vậy có thể bị tấn công và bất hoạt bởi enzyme khác có khả năng phân giải phần protein của enzyme. Sự ức chế enzyme hóa nâu trong kiwi cắt và bột kiwi khi tiếp xúc với actinidin, một protease hoạt tính cao (Labuza et
al., 1990). Ba protease thực vật khác gồm ficin từ sung, papain từ đu đủ và bromelin
từ thơm được chứng minh là hiệu quả trong điều khiển enzyme hóa nâu mà đặc biệt là enzyme ficin có tác động mạnh hơn. [30]
Những enzyme khác ngăn chặn sự hóa nâu bởi việc loại bỏ cơ chất phenolic bằng sự cải biến hóa học. Sử dụng o-methyltransferase để methyl hóa o-dihydroxy phenolic thành dẫn xuất methoxy tương ứng. Kelly và Finkle xử lý nước táo với enzym protocatechuate 3,4-dioxygenase từ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa xúc tác phản ứng oxi hóa mở vòng và phân đôi ortho của catechol, nước táo có xử lý enzyme không bị đen khi so sánh với mẫu đối chứng không xử lý. Tuy nhiên việc xử lý enzyme ngăn chặn sự hóa nâu có giá thành cao và không thích hợp ứng dụng trong sản xuất thương mại. [30]
1.2.8.4. Phƣơng pháp gen
Công nghệ sinh học phân tử mở ra triển vọng điều khiển sự biểu hiện của PPO thông qua điều khiển sản xuất các protein bên trong tế bào, qua thao tác gen có thể sử dụng ức chế PPO trong cây chuyển gen bởi sự biểu hiện PPO trong định hướng antisense. Sự biểu hiện của PPO trong khoai tây giảm bởi sử dụng vector mang antisense PPO cDNA. [30, 47].
1.2.9. Cơ chất của polyphenol oxidase : Phenol
Phenol là hợp chất có vòng thơm có nhóm hydroxyl gắn trực tiếp vào vòng benzen