CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2.6. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của
Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO được khảo sát trong các dung dịch đệm với pH khác nhau 3, 4, 5, 6, 7, 8 (pH 3, 4, 5 với dung dịch đệm acid citric – Na2HPO4 0,1M; pH 6, 7, 8 với dung dịch đệm Na2HPO4 - NaH2PO4 0,1M). Các yếu tố khác như nhiệt độ, nồng độ cơ chất, thời gian phản ứng được giữ ổn định. Hoạt độ của PPO được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 theo sự thay đổi của pH từ 3,0 – 8,0.
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme ở những giá trị pH tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc hoạt độ của PPO vào pH, từ đó ta xác định được pH tối ưu cho hoạt động của enzyme tương ứng với hoạt độ cao nhất. 2.2.6.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO [29,41]
Enzyme được ủ trong các dung dịch đệm với pH khác nhau (3,0 – 8,0) trong thời gian 30 phút. Sau thời gian ủ, tiến hành xác định hoạt độ của enzyme theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 và tính phần trăm hoạt độ còn lại so với hoạt độ cao nhất của enzyme.
Sau khi tiến hành xác định phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme sau khi ủ ở những giá trị pH tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme so với hoạt độ cao nhất vào pH, từ đó ta xác định được độ bền của enzyme ở các giá trị pH khác nhau.
2.2.6.3. Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO[43]
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO được khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80oC. Hỗn hợp phản ứng gồm : 1,9 ml dung dịch đệm
0,1 M với pH tối ưu; 1,0ml cơ chất catechol 0,05M. Đặt hỗn hợp vào nhiệt độ thích hợp cần khảo sát. Sau khi đạt được nhiệt độ cần thiết cho 0,1ml dịch chiết enzyme vào hỗn hợp phản ứng. Hoạt độ của enzyme được xác định theo phương pháp nêu
trong mục 2.2.3 với sự thay đổi của nhiệt độ từ 20 – 80oC, các yếu tố khác như pH, nồng độ cơ chất, thời gian phản ứng được giữ ổn định.
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ ở những nhiệt độ tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa hoạt độ của enzyme và nhiệt độ, từ đó ta xác định được nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO tương ứng với hoạt độ cao nhất.
2.2.6.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO [29,41]
Enzyme được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 40 đến 80oC trong thời gian 30 phút. Sau thời gian ủ, tiến hành xác định hoạt độ của enzyme và tính phần trăm hoạt độ còn lại so với hoạt độ cao nhất. Hỗn hợp phản ứng gồm: 0,1ml dịch chiết enzyme trong 1,9 ml dung dịch đệm 0,1 M với pH tối ưu. Hỗn hợp được đặt vào trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ cần khảo sát trong 30 phút. Sau thời gian ủ cho ngay hỗn hợp vào nước đá lạnh. Sau đó 1,0ml cơ chất catechol 0,05M được thêm vào để bắt đầu phản ứng của enzyme. Hoạt độ PPO được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3.
Sau khi tiến hành xác định phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme sau khi ủ ở những giá trị nhiệt độ tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme so với hoạt độ cao nhất vào nhiệt độ, từ đó ta xác định được độ bền của enzyme ở các nhiệt độ khác nhau.
2.2.6.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian [13, 19, 36]
Enzyme trong dung dịch đệm 0,1 M ở pH tối ưu được ủ trong các nhiệt độ khác nhau từ 60 đến 80oC trong các khoảng thời gian khác nhau từ 5 đến 40 phút. Hỗn hợp phản ứng gồm enzyme với dung dịch đệm 0,1M với pH tối ưu được đặt vào trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ cần khảo sát. Sau khoảng thời gian 5 phút, 2ml hỗn hợp được lấy ra và cho ngay vào trong nước đá. Sau đó 1,0ml cơ chất catechol 0,05M được cho vào hỗn hợp để bắt đầu phản ứng của enzyme. Hoạt độ PPO được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3. Lặp lại phản ứng trong mỗi 5 phút đến 40 phút.
Sau khi tiến hành xác định phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme so với hoạt độ ban đầu sau khi ủ ở những giá trị nhiệt độ tương ứng trong các khoảng thời gian
khác nhau, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc phần trăm hoạt độ còn lại của
enzyme vào nhiệt độ theo thời gian so với hoạt độ ban đầu của enzyme, từ đó ta xác định được độ bền của enzyme ở các nhiệt độ khác nhau theo thời gian.
2.2.6.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của PPO[18, 32]
Hoạt độ của enzyme được khảo sát với các nồng độ cơ chất (catechol) từ 10 đến 100mM. Các yếu tố khác như nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng được giữ ổn định.
Hoạt độ của enzyme được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 theo sự thay đổi của nồng độ cơ chất từ 10 – 100mM.
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme ở những nồng độ cơ chất tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa hoạt độ của enzyme và nồng độ cơ chất, ta xác định được nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của enzyme.
2.2.6.7. Phương pháp khảo sát động học phản ứng PPO theo thời gian
Hỗn hợp phản ứng gồm 1,9 ml dung dịch đệm 0,1 M với pH tối ưu; 1,0ml cơ chất catechol ở nồng độ tối ưu; 0,1ml dịch chiết enzyme. Đo sự tăng độ hấp thu mật độ quang tại bước sóng 420nm ở các thời điểm 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 phút với nhiệt độ tối ưu. Xác định lượng sản phẩm tạo thành theo thời gian phản ứng.
Sau khi tiến hành xác định lượng sản phẩm tạo thành theo thời gian phản ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa lượng sản phẩm tạo thành theo thời gian phản ứng của PPO.
2.2.6.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của PPO[ 36]
Enzyme PPO bị ức chế bởi nhiều chất khác nhau. Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế khác nhau đến hoạt động của enzyme, các chất ức chế gồm acid ascorbic, acid citric, NaCl ở các nồng độ 1, 5, 10, 50, 100 mM. Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1ml dịch chiết enzyme được ủ với 1,8 ml dung dịch đệm 0,1 M với pH tối ưu và 0,1ml
độ tối ưu được thêm vào để xác định hoạt độ của PPO theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme ở những nồng độ khác nhau của chất ức chế, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa phần trăm hoạt độ mất đi của enzyme so với hoạt độ ban đầu và nồng độ khác nhau của chất ức chế, ta xác định được nồng độ ức chế mạnh nhất đến hoạt động của enzyme.
2.2.7. Phương pháp nghiên cứu ứng dụng enzyme trong tạo màu cho sản phẩm trà trong công nghệ chế biến trà
Quá trình chế biến trà là sự vận dụng linh hoạt và tài tình hệ enzyme oxi hóa khử có sẵn trong nguyên liệu ban đầu. Từ búp trà, lá trà người ta có thể sản xuất các loại trà đen, trà xanh, trà nâu, …, với màu sắc và hương vị khác nhau.
2.2.7.1. Phương pháp nghiên cứu sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế biến trà
* Trong công nghệ chế biến trà đen: Nghiền 2 gram lá trà trong 20 ml dung dịch đệm phosphate pH7, lọc qua giấy lọc, đo sự thay đổi màu của dung dịch ở bước sóng 420nm trong mỗi 5 phút trong 60 phút. Sau đó ta vẽ đồ thị biểu diễn sự thay đổi giá trị OD của dung dịch theo thời gian.
* Trong công nghệ chế biến trà xanh: Xử lý 2 gram lá trà trong nước đun sôi trong 5 phút để bất hoạt PPO. Nghiền lá trà sau khi xử lí trong 20 ml dung dịch đệm phosphate pH7, lọc qua giấy lọc, đo sự thay đổi màu của dung dịch ở bước sóng 420nm trong mỗi 5 phút trong 60 phút. Sau đó ta vẽ đồ thị biểu diễn sự thay đổi giá trị OD của dung dịch theo thời gian.
2.2.7.2. Phương pháp chế biến trà đen [5, 8, 9]
* Nguyên tắc: Cơ sở sinh hóa quan trọng trong chế biến trà đen là tạo điều kiện tối ưu cho hoạt động của hệ enzyme oxi hóa mà chủ yếu là PPO oxi hóa hợp chất tanin thành quinon có màu đen sẫm của trà thành phẩm
* Quá trình chế biến trà đen có thể tóm tắt như sau Nguyên liệu trà
Độ ẩm không khí 60 Nhiệt độ 44 – 45 oC – 70%
Thời gian 3 – 4 giờ
Độ ẩm không khí 90 – 92%
Nhiệt độ 20 – 25oC
Thời gian 45 phút
Độ ẩm không khí 98%
Nhiệt độ 24 – 26oC Thời gian 3 – 3,5
giờ
Nhiệt độ 90 – 105oC Thời gian 30 – 40 phút
Phân loại và đóng gói trà 2.2.7.3. Phương pháp chế biến trà xanh [5, 8,9]
* Nguyên tắc: Khác với quá trình chế biến trà đen, quá trình chế biến trà xanh không có giai đoạn làm héo và lên men. Tất cả hoạt động của enzyme oxi hóa được đình chỉ ngay giai đoạn đầu tiên của qui trình bằng phương pháp sử dụng nhiệt độ cao nên quá trình oxi hóa tannin không xảy ra.
* Quá trình chế biến trà xanh có thể tóm tắt như sau Nguyên liệu trà
Làm héo trà
Vò trà
Lên men trà
Sấy khô trà
Nhiệt độ 95 – 100oC Thời gian 5 – 7 phút
Độ ẩm không khí 90 %
Nhiệt độ 22 – 24oC
Thời gian 30 - 45 phút
Nhiệt độ 90 – 105oC
Thời gian 30 – 40 phút
Phân loại và đóng gói trà