Hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme được tính theo công thức sau:
Hoạt độ chung (ΣUI/g hay /ml CPE) Hoạt độ riêng (HđR) =
Hàm lượng Protein (mg/g hay /ml CPE)
= UI mgPr E
2.2.6. Phƣơng pháp xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ của PPO
2.2.6.1. Phƣơng pháp xác định pH tối ƣu cho hoạt động của PPO [26,36]
Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO được khảo sát trong các dung dịch đệm với pH khác nhau 3, 4, 5, 6, 7, 8 (pH 3, 4, 5 với dung dịch đệm acid citric – Na2HPO4 0,1M; pH 6, 7, 8 với dung dịch đệm Na2HPO4 - NaH2PO4 0,1M). Các yếu tố khác như nhiệt độ, nồng độ cơ chất, thời gian phản ứng được giữ ổn định. Hoạt độ của PPO được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 theo sự thay đổi của pH từ 3,0 – 8,0.
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme ở những giá trị pH tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc hoạt độ của PPO vào pH, từ đó ta xác định được pH tối ưu cho hoạt động của enzyme tương ứng với hoạt độ cao nhất. 2.2.6.2. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của pH đến độ bền của PPO [29,41]
Enzyme được ủ trong các dung dịch đệm với pH khác nhau (3,0 – 8,0) trong thời gian 30 phút. Sau thời gian ủ, tiến hành xác định hoạt độ của enzyme theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 và tính phần trăm hoạt độ còn lại so với hoạt độ cao nhất của enzyme.
Sau khi tiến hành xác định phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme sau khi ủ ở những giá trị pH tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme so với hoạt độ cao nhất vào pH, từ đó ta xác định được độ bền của enzyme ở các giá trị pH khác nhau.
2.2.6.3. Phƣơng pháp xác định nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của PPO[43]
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO được khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80oC. Hỗn hợp phản ứng gồm : 1,9 ml dung dịch đệm
0,1 M với pH tối ưu; 1,0ml cơ chất catechol 0,05M. Đặt hỗn hợp vào nhiệt độ thích hợp cần khảo sát. Sau khi đạt được nhiệt độ cần thiết cho 0,1ml dịch chiết enzyme vào hỗn hợp phản ứng. Hoạt độ của enzyme được xác định theo phương pháp nêu
trong mục 2.2.3 với sự thay đổi của nhiệt độ từ 20 – 80oC, các yếu tố khác như pH, nồng độ cơ chất, thời gian phản ứng được giữ ổn định.
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ ở những nhiệt độ tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa hoạt độ của enzyme và nhiệt độ, từ đó ta xác định được nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO tương ứng với hoạt độ cao nhất.
2.2.6.4. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO [29,41]
Enzyme được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 40 đến 80oC trong thời gian 30 phút. Sau thời gian ủ, tiến hành xác định hoạt độ của enzyme và tính phần trăm hoạt độ còn lại so với hoạt độ cao nhất. Hỗn hợp phản ứng gồm: 0,1ml dịch chiết enzyme trong 1,9 ml dung dịch đệm 0,1 M với pH tối ưu. Hỗn hợp được đặt vào trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ cần khảo sát trong 30 phút. Sau thời gian ủ cho ngay hỗn hợp vào nước đá lạnh. Sau đó 1,0ml cơ chất catechol 0,05M được thêm vào để bắt đầu phản ứng của enzyme. Hoạt độ PPO được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3.
Sau khi tiến hành xác định phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme sau khi ủ ở những giá trị nhiệt độ tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme so với hoạt độ cao nhất vào nhiệt độ, từ đó ta xác định được độ bền của enzyme ở các nhiệt độ khác nhau.
2.2.6.5. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời gian [13, 19, 36]
Enzyme trong dung dịch đệm 0,1 M ở pH tối ưu được ủ trong các nhiệt độ khác nhau từ 60 đến 80oC trong các khoảng thời gian khác nhau từ 5 đến 40 phút. Hỗn hợp phản ứng gồm enzyme với dung dịch đệm 0,1M với pH tối ưu được đặt vào trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ cần khảo sát. Sau khoảng thời gian 5 phút, 2ml hỗn hợp được lấy ra và cho ngay vào trong nước đá. Sau đó 1,0ml cơ chất catechol 0,05M được cho vào hỗn hợp để bắt đầu phản ứng của enzyme. Hoạt độ PPO được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3. Lặp lại phản ứng trong mỗi 5 phút đến 40 phút.
Sau khi tiến hành xác định phần trăm hoạt độ còn lại của enzyme so với hoạt độ ban đầu sau khi ủ ở những giá trị nhiệt độ tương ứng trong các khoảng thời gian
khác nhau, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc phần trăm hoạt độ còn lại của
enzyme vào nhiệt độ theo thời gian so với hoạt độ ban đầu của enzyme, từ đó ta xác định được độ bền của enzyme ở các nhiệt độ khác nhau theo thời gian.
2.2.6.6. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của PPO[18, 32]
Hoạt độ của enzyme được khảo sát với các nồng độ cơ chất (catechol) từ 10 đến 100mM. Các yếu tố khác như nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng được giữ ổn định. Hoạt độ của enzyme được xác định theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 theo sự thay đổi của nồng độ cơ chất từ 10 – 100mM.
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme ở những nồng độ cơ chất tương ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa hoạt độ của enzyme và nồng độ cơ chất, ta xác định được nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của enzyme.
2.2.6.7. Phƣơng pháp khảo sát động học phản ứng PPO theo thời gian
Hỗn hợp phản ứng gồm 1,9 ml dung dịch đệm 0,1 M với pH tối ưu; 1,0ml cơ chất catechol ở nồng độ tối ưu; 0,1ml dịch chiết enzyme. Đo sự tăng độ hấp thu mật độ quang tại bước sóng 420nm ở các thời điểm 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 phút với nhiệt độ tối ưu. Xác định lượng sản phẩm tạo thành theo thời gian phản ứng.
Sau khi tiến hành xác định lượng sản phẩm tạo thành theo thời gian phản ứng, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa lượng sản phẩm tạo thành theo thời gian phản ứng của PPO.
2.2.6.8. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của chất ức chế đến hoạt động của PPO[ 36]
Enzyme PPO bị ức chế bởi nhiều chất khác nhau. Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế khác nhau đến hoạt động của enzyme, các chất ức chế gồm acid ascorbic, acid citric, NaCl ở các nồng độ 1, 5, 10, 50, 100 mM. Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1ml dịch chiết enzyme được ủ với 1,8 ml dung dịch đệm 0,1 M với pH tối ưu và 0,1ml
độ tối ưu được thêm vào để xác định hoạt độ của PPO theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3
Sau khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme ở những nồng độ khác nhau của chất ức chế, ta vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa phần trăm hoạt độ mất đi của enzyme so với hoạt độ ban đầu và nồng độ khác nhau của chất ức chế, ta xác định được nồng độ ức chế mạnh nhất đến hoạt động của enzyme.
2.2.7. Phƣơng pháp nghiên cứu ứng dụng enzyme trong tạo màu cho sản phẩm trà trong công nghệ chế biến trà
Quá trình chế biến trà là sự vận dụng linh hoạt và tài tình hệ enzyme oxi hóa khử có sẵn trong nguyên liệu ban đầu. Từ búp trà, lá trà người ta có thể sản xuất các loại trà đen, trà xanh, trà nâu, …, với màu sắc và hương vị khác nhau.
2.2.7.1. Phƣơng pháp nghiên cứu sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế biến trà
*Trong công nghệ chế biến trà đen: Nghiền 2 gram lá trà trong 20 ml dung dịch đệm phosphate pH7, lọc qua giấy lọc, đo sự thay đổi màu của dung dịch ở bước sóng 420nm trong mỗi 5 phút trong 60 phút. Sau đó ta vẽ đồ thị biểu diễn sự thay đổi giá trị OD của dung dịch theo thời gian.
*Trong công nghệ chế biến trà xanh: Xử lý 2 gram lá trà trong nước đun sôi trong 5 phút để bất hoạt PPO. Nghiền lá trà sau khi xử lí trong 20 ml dung dịch đệm phosphate pH7, lọc qua giấy lọc, đo sự thay đổi màu của dung dịch ở bước sóng 420nm trong mỗi 5 phút trong 60 phút. Sau đó ta vẽ đồ thị biểu diễn sự thay đổi giá trị OD của dung dịch theo thời gian.
2.2.7.2. Phƣơng pháp chế biến trà đen [5, 8, 9]
*Nguyên tắc: Cơ sở sinh hóa quan trọng trong chế biến trà đen là tạo điều kiện tối ưu cho hoạt động của hệ enzyme oxi hóa mà chủ yếu là PPO oxi hóa hợp chất tanin thành quinon có màu đen sẫm của trà thành phẩm
*Quá trình chế biến trà đen có thể tóm tắt như sau
Nguyên liệu trà
Độ ẩm không khí 60 Nhiệt độ 44 – 45 oC – 70%
Thời gian 3 – 4 giờ
Độ ẩm không khí 90 – 92%
Nhiệt độ 20 – 25oC
Thời gian 45 phút
Độ ẩm không khí 98%
Nhiệt độ 24 – 26oC Thời gian 3 – 3,5
giờ
Nhiệt độ 90 – 105oC Thời gian 30 – 40 phút
Phân loại và đóng gói trà
2.2.7.3. Phƣơng pháp chế biến trà xanh [5, 8,9]
* Nguyên tắc: Khác với quá trình chế biến trà đen, quá trình chế biến trà xanh không có giai đoạn làm héo và lên men. Tất cả hoạt động của enzyme oxi hóa được đình chỉ ngay giai đoạn đầu tiên của qui trình bằng phương pháp sử dụng nhiệt độ cao nên quá trình oxi hóa tannin không xảy ra.
* Quá trình chế biến trà xanh có thể tóm tắt như sau
Nguyên liệu trà Làm héo trà Vò trà Lên men trà Sấy khô trà
Nhiệt độ 95 – 100oC Thời gian 5 – 7 phút Độ ẩm không khí 90 % Nhiệt độ 22 – 24oC Thời gian 30 - 45 phút Nhiệt độ 90 – 105oC Thời gian 30 – 40 phút
Phân loại và đóng gói trà
2.2.8. Phƣơng pháp nghiên cứu một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây [7, 15,16]
* Nguyên tắc
Trong tế bào rau củ, trái cây có chứa hợp chất phenol và PPO. Khi rau củ, trái cây bị tổn thương hay khi cắt gọt, các tế bào vỡ ra ở mặt cắt cơ học của rau củ, trái cây PPO oxi hóa hợp chất phenol thành quinon, làm sẫm màu rau củ trái cây trong điều kiện có oxi. Sử dụng nhiệt độ, pH acid, một số hóa chất hay enzyme protease để kiềm chế hoạt động của PPO sẽ hạn chế sự sẫm màu của rau củ, trái cây khi cắt gọt và bảo quản.
* Tiến hành
Táo tây, khoai tây cắt lát kích thước 1cm x 5cm x 0,5 cm, sau đó tiến hành thí nghiệm những tác nhân ức chế hoạt động của PPO
- Sử dụng nhiệt độ để kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây: 3 mẫu thí nghiệm cho mỗi loại nguyên liệu khoai tây và táo tây, mẫu 1 giữ ở nhiệt độ phòng (28 – 30oC), mẫu 2 đun sôi ở 100oC trong 1 phút, mẫu 3 giữ ở nhiệt
độ lạnh 4oC. Ghi nhận và so sánh thời gian sẫm màu của 3 mẫu nêu trên.
- Sử dụng pH thấp (2, 3, 4) để kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây: Nhúng mẫu táo tây và khoai tây vào các dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 0,1M với pH khác nhau 2, 3, 4 trong 5 phút.
Cố định trà
Vò trà
Lấy ra đặt vào đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Ghi nhận thời gian sẫm màu của mẫu xử lý với pH so với mẫu không xử lý.
- Sử dụng hóa chất để kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây: Nhúng mẫu táo tây và khoai tây vào dung dịch acid ascorbic, acid citric, NaCl nồng độ 100mM trong 5 phút. Lấy ra đặt vào đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Ghi nhận thời gian sẫm màu của mẫu xử lý với hóa chất so với mẫu không xử lý.
- Sử dụng enzyme protease để kiềm chế tác hại của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây: Nhúng mẫu táo tây và khoai tây vào dung dịch enzyme ficin và bromelin trong 5 phút. Lấy ra đặt vào đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Ghi nhận thời gian sẫm màu của mẫu xử lý so với mẫu không xử lý.
2.2.9. Phƣơng pháp thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu
Nghiền khoảng 40 gram lá trà trong 100ml dung dịch đệm photphat pH7 có chứa 15mg/ml PVP (polyvinyl pyrolidone). Hỗn hợp được lọc qua vải thường. Thu dịch lọc và ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút ở 4oC. Thu dịch nổi chứa enzyme polyphenol oxidase. Dịch nổi đem tủa với ethanol 90o lạnh với tỉ lệ
Vdung dịch E/Vethanol là 1: 3. Khi tủa cần cho từ từ ethanol lạnh vào dung dịch enzyme và vừa cho ethanol vào vừa khuấy đều dung dịch, để yên trong tủ lạnh trong 1giờ để tủa enzyme. Ly tâm thu tủa, tủa được trộn với tinh bột tỉ lệ khoảng 1:1, sấy khô hỗn hợp ở nhiệt độ 40 – 42oC, thu chế phẩm enzyme thô, bảo quản ở nhiệt độ 0 – 4oC. Xác định hoạt độ chung và hoạt độ riêng của chế phẩm PPO thô theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3 và 2.2.5
2.2.10. Phƣơng pháp xử lí số liệu thực nghiệm Kết quả thí nghiệm được xử lí với phần mềm excel
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Khảo sát các đặc tính của lá trà nguyên liệu 3.1.1.Xác định độ ẩm của lá trà 3.1.1.Xác định độ ẩm của lá trà
Lá trà được sử dụng trong thí nghiệm thuộc dạng tươi được mua tại các chợ trên địa bàn TPHCM, đầu tiên chúng tôi tiến hành xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi, kết quả được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Độ ẩm của lá trà nguyên liệu
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Trọng lượng nguyên liệu và đĩa trước khi
sấy (g) 40,6315 40,8452 42,4476
Trọng lượng nguyên liệu và đĩa sau khi sấy
(g) 36,7667 36,8117 38,3181
Trọng lượng của nước (g) 3,8648 4,0335 4,1295 Trọng lượng nguyên liệu trước khi sấy (g) 5,3590 5,5797 5,6940
Độ ẩm của nguyên liệu (%) 72,12 72,29 72,52
Độ ẩm trung bình của nguyên liệu (%) 72,31 ± 0,20 1
Kết quả thể hiện trong bảng 3.1 cho thấy rằng độ ẩm của lá trà nguyên liệu là 72,31% gần tương đương với hàm lượng nước trong búp trà 76% và trong lá trà non là 74 – 75% do độ ẩm của nguyên liệu tùy thuộc vào độ non của lá trà [5,9] .
3.1.2.Xác định hoạt độ của PPO trong nguyên liệu
Chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ của PPO trong nguyên liệu (nguyên liệu khô) theo phương pháp nêu trong mục 2.2.3, kết quả được trình bày trong bảng 3.2
HđC (UI/gNL) 2200,97 2192,66 2274,29
HđC TB (UI/gNL) 2222,64 ± 44,923
Kết quả bảng 3.2 thể hiện hoạt độ chung của PPO trong nguyên liệu là 2222,64 UI/gNL là khá cao, vì vậy có thể sử dụng lá trà làm nguyên liệu thu nhận PPO cho các nghiên cứu tiếp theo.
Trước khi tiến hành xác định hàm lượng protein có trong nguyên liệu, chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn Bradford với chất chuẩn là albumin. Kết quả thể hiện trong phần phụ lục mục 5.2.
Sau khi xây dựng đường chuẩn Bradford, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu (dịch trích enzyme/gNL), kết quả được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3. Hàm lượng protein trong nguyên liệu (dịch trích enzyme/gNL)
Mẫu 1 2 3
Hàm lượng protein (mg/gNL) 8,02 8,02 8,13
Hàm lượng protein TB
(mg/gNL) 8,06 ± 0,06
Kết quả bảng 3.3 thể hiện hàm lượng protein trung bình trong nguyên liệu ban đầu là 8,06mg/gNL
3.1.4.Xác định hoạt độ riêng của PPO trong nguyên liệu
Chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ riêng của PPO trong nguyên liệu theo phương pháp nêu ở mục 2.2.5. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4