Chúng tôi tiến hành xác định động học phản ứng của PPO theo thời gian trên cơ chất catechol (với thể tích 1ml catechol 0,05M) tạo sản phẩm benzoquinon theo phương pháp nêu trong mục 2.2.6.7, phương pháp xác định nồng độ của benzoquinon tạo thành được nêu trong phần phụ lục mục 5.4. Kết quả xác định động học phản ứng của PPO theo thời gian được trình bày trong bảng 3.11 và đồ thị 3.7.
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát động học phản ứng của PPO theo thời gian Thời gian (phút) ∆OD420nm Lượng benzoquinon tạo thành
(mM) 0 0,000 0,00 5 0,337 67,40 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
10 0,414 82,80 15 0,420 84,00 20 0,417 83,40 25 0,414 82,80 30 0,405 81,00 35 0,392 78,40 40 0,377 75,40 45 0,368 73,60 50 0,364 72,80 55 0,364 72,80 60 0,357 71,40 Thời gian (phút)
Đồ thị 3.7. Động học phản ứng của PPO theo thời gian
Kết quả bảng 3.11 và đồ thị 3.7 thể hiện rằng PPO hoạt động oxi hóa cơ chất catechol tạo sản phẩm benzoquinon nhiều nhất ở 15 phút, sau đó lượng sản phẩm tạo thành không tăng nữa mà có xu hướng giảm do benzoquinon không bền dễ bị biến đổi thành các chất khác theo thời gian.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
PPO bị ức chế bởi nhiều chất hóa học khác nhau, ảnh hưởng của acid ascorbic, acid citric, NaCl ở các nồng độ khác nhau trên hoạt động của PPO được khảo sát theo phương pháp nêu trong mục 2.2.6.8 và kết quả được thể hiện trong bảng 3.12 và biểu đồ 3
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độ của PPO Nồng độ chất ức chế (mM) 0 1 5 10 50 100 % Hđ mất đi/ Hđ ban đầu Acid ascorbic 0,00 12,18 91,54 98,31 99,66 100,00 Acid citric 0,00 8,46 20,98 33,84 50,08 53,30 NaCl 0,00 7,61 8,46 15,91 31,81 34,52 Nồng độ chất ức chế (mM)
Biểu đồ 3. Ảnh hưởng của các chất ức chế khác nhau đến hoạt độ của PPO
Kết quả bảng 3.11 và biểu đồ 3 cho thấy rằng PPO bị ức chế bởi một số hóa chất như acid ascorbic, acid citric, NaCl. Trong đó acid ascorbic là chất ức chế mạnh nhất đến hoạt động của PPO hơn 90% hoạt độ của enzyme bị mất đi ở nồng độ 5mM và gần như bị bất hoạt hoàn toàn ở nồng độ lớn hơn 10mM. NaCl là chất ức chế yếu
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 5 10 50 100 Acid ascorbic Acid citric NaCl
đi ở nồng độ 100mM. Kết quả khảo sát này phù hợp với nghiên cứu của Unal và cộng sự (2011) với acid ascorbic ức chế hiệu quả đến hoạt động của PPO trong lá trà với khoảng 15,5% hoạt độ bị mất đi ở nồng độ 1mM.
Ảnh hưởng của các chất ức chế khác nhau đến hoạt độ của PPO cũng được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau như ở xoài hoạt động của PPO bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ acid ascorbic 1 mM (Wang và cộng sự, 2006), quả Anh đào hoạt động của PPO bị ức chế 97,5% hoạt độ ở nồng độ acid ascorbic là 0,6mM và bị ức chế 97,8% hoạt độ ở nồng độ acid citric 1mM (Gao Jia và cộng sự, 2011), ở khoai sọ PPO bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ acid ascorbic là 0,8mM. 3.3. Ứng dụng PPO trong tạo màu cho trà trong công nghệ chế biến trà
3.3.1. Sự thay đổi màu của dung dịch do sự oxi hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế biến trà * Trong công nghệ chế biến trà đen
Trong quá trình chế biến trà đen do hoạt động của PPO oxi hóa các hợp chất polyphenol có sẵn trong lá trà thành quinon làm thay đổi màu của trà tạo trà đen. Sự thay đổi màu trong quá trình chế biến trà đen được thể hiện qua mẫu thí nghiệm (nghiền 2g lá trà trong 20 ml dung dịch đệm phosphate pH7, lọc qua giấy lọc, đo sự thay đổi màu của dung dịch ở bước sóng 420nm trong mỗi 5 phút trong 60 phút). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.13 và đồ thị 3.8
Bảng 3.13. Sự thay đổi OD420nm trong quá trình chế biến trà đen (mẫu TN)
Thời gian (phút) OD420nm TB
0 0,303 ± 0,012
5 0,320 ± 0,012
10 0,339 ± 0,014
25 0,404 ± 0,017 30 0,433 ± 0,017 35 0,464 ± 0,011 40 0,483 ± 0,011 45 0,502 ± 0,010 50 0,519 ± 0,010 55 0,536 ± 0,010 60 0,554 ± 0,004 Thời gian (phút)
Đồ thị 3.8: Sự thay đổi OD420nm theo thời gian trong chế biến trà đen (mẫu TN) Kết quả bảng 3.13 và đồ thị 3.8 cho thấy rằng có sự hoạt động của PPO oxi hóa hợp chất polyphenol trong lá trà thành quinon tạo màu cho sản phẩm trà đen.
* Trong công nghệ chế biến trà xanh
Trong quá trình chế biến trà xanh, giai đoạn cố định làm bất hoạt PPO bởi nhiệt ở 100oC, do đó không xảy ra quá trình oxi hóa hợp chất polyphenol trong lá trà. Sự thay đổi OD trong chế biến trà xanh được thể hiện qua mẫu thí nghiệm (xử lý 2g lá trà trong nước đun sôi trong 5 phút để bất hoạt PPO. Nghiền lá trà sau khi xử lí trong 20 ml dung dịch đệm phosphate pH7, lọc qua giấy lọc, đo sự thay đổi màu của dung dịch
2 , 0 , 3 0 0 , 4 0 , 5 0 , 6 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
ở bước sóng 420nm trong mỗi 5 phút trong 60 phút). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.14 và đồ thị 3.9.
Bảng 3.14. Sự thay đổi OD420nm trong quá trình chế biến trà xanh (mẫu TN)
Thời gian (phút) OD420nm TB 0 0,371± 0,002 5 0,371± 0,004 10 0,372± 0,003 15 0,371± 0,003 20 0,372± 0,004 25 0,372± 0,002 30 0,372± 0,002 35 0,372± 0,004 40 0,372± 0,003 45 0,372± 0,004 50 0,372± 0,004 55 0,372± 0,003 60 0,372± 0,003
Thời gian (phút)
Đồ thị 3.9. Sự thay đổi OD420nm theo thời gian trong chế biến trà xanh (mẫu TN) Kết quả bảng 3.14 và đồ thị 3.9 cho thấy do PPO bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao nên không có quá trình oxi hóa các polyphenol trong quá trình chế biến trà xanh.
3.3. 2. Sản phẩm trà đen
Quá trình chế biến trà đen được nêu trong mục 2.2.7.2. Trong quá trình chế biến trà đen xảy ra quá trình oxi hóa hợp chất polyphenol trong lá trà thành quinon do hoạt động của PPO tạo màu cho sản phẩm trà đen. Sản phẩm trà đen được thể hiện trong hình 3.1 và 3.3. , 0 2 , 0 3 4 0 , 5 , 0 0 , 6 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5
Hình 3. 1. Sản phẩm trà đen
3.3.3. Sản phẩm trà xanh
Quá trình chế biến trà xanh được nêu trong mục 2.2.7.3. Trong quá trình chế biến trà xanh không có quá trình oxi hóa hợp chất polyphenol trong lá trà do PPO bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao trong giai đoạn cố định trà. Sản phẩm trà xanh được thể hiện trong hình 3.2 và 3.3.
Hình 3.2. Sản phẩm trà xanh
Hình 3.3. Nước trà đen và trà xanh
3.4. Một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO trong sẫm màu rau quả Trái cây và rau củ trong quá trình thu hoạch, chế biến và bảo quản thường bị hóa nâu do hoạt và rau củ trong quá trình thu hoạch, chế biến và bảo quản thường bị hóa nâu do hoạt động của PPO oxi hóa hợp chất phenol thành quinon tạo màu nâu trong trái cây và rau củ bị tổn thương làm giảm giá trị kinh tế của nhiều loại rau quả. Để hạn chế hiện tượng hóa nâu trong rau củ và trái cây trong quá trình bảo quản và chế biến thì cần ức chế hoạt động của PPO. Có nhiều phương pháp để ức chế enzyme hóa nâu, tuy nhiên việc lựa chọn phương pháp phù hợp tùy thuộc vào nguồn gốc của PPO, rút ngắn quy trình sản xuất, phụ thuộc vào giá thành của phương pháp và sự chấp nhận của người tiêu dùng đối với phương pháp sử dụng nên trong công nghiệp thực phẩm thường sử dụng các phương pháp để ức chế PPO như nhiệt độ, pH và một số acid hữu cơ như acid ascorbic, acid citric,….Một số phương pháp ức chế PPO như nhiệt độ, pH, enzyme, acid hữu cơ được chúng tôi tiến hành trên táo tây và khoai tây cắt.
3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ thấp (0-10oC) có tác dụng kìm hãm hoạt động của enzyme hay nhiệt độ cao (100oC) có tác dụng vô hoạt PPO. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của rau củ và trái cây được nêu trong mục 2.2.8. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.15.
Bảng 3.15. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của rau quả Nguyên liệu Nhiệt độ (oC) Thời gian sẫm màu
Khoai tây 4 2 giờ 54 phút to phòng (28 – 30) 51 phút 100 Trên 8 giờ Táo tây 4 2 giờ 26 phút to phòng (28 – 30) 16 phút 100 Trên 8 giờ
Kết quả bảng 3.15 thể hiện rằng mẫu được xử lý ở nhiệt độ thấp (0-10oC) hay nhiệt độ cao (100oC) đều có thời gian sẫm màu chậm hơn mẫu đặt ở nhiệt độ phòng (28 – 30 oC) nên có thể dùng nhiệt độ thấp hay nhiệt độ cao để làm chậm sự sẫm màu của rau củ và trái cây khi cắt gọt.
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH
Mỗi enzyme có pH hoạt động tối ưu, PPO thường có pH hoạt động tối ưu gần pH trung tính, do đó có thể dùng pH thấp (2,3,4) để kiềm chế hoạt động của PPO. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của rau củ và trái cây được thể hiện trong mục 2.2.8. Kết quả thể hiện trong bảng 3.16.
Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của rau quả Nguyên liệu Mẫu không
xử lí
Mẫu có xử lí
pH2 pH3 pH4
Thời gia n sẫm màu
Khoai tây 45 phút 4 giờ 24 phút 4 giờ 04 phút 3 giờ 34 phút Táo tây 7 phút 4 giờ 55 phút 4 giờ 15 phút 3 giờ 45 phút
Kết quả bảng 3.16 thể hiện rằng khi xử mẫu ở pH thấp (2, 3, 4) đều có thời gian sẫm màu chậm hơn so với mẫu không được xử lí nên có thể dùng pH thấp để làm chậm sự sẫm màu của rau củ và trái cây khi cắt gọt. pH càng thấp khả năng ức chế enzyme càng cao nên thời gian bị sẫm màu càng chậm hơn.
3.4. 3. Sử dụng hóa chất
Hóa chất có thể ức chế hay điều khiển sự hóa nâu do có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme không thể xúc tác phản ứng oxi hóa polyphenol thành quinon hay có khả năng khử o-quinon thành o-diphenol ban đầu hoặc bất hoạt không thuận nghịch PPO nên có thể sử dụng một số hóa chất như acid ascorbic, acid citric, NaCl để điều khiển sự hóa nâu của rau củ và trái cây. Phương pháp sử dụng một số hóa chất để kiềm chế sự hóa nâu được nêu trong mục
2.2.8 và kết quả thể hiện trong bảng 3.17.
Mẫu không xử lí
Acid ascorbic Acid citric NaCl Thời gian sẫm màu
Khoai tây 43 phút 6 giờ 26 phút 5 giờ 31 phút 3 giờ 34 phút Táo tây 9 phút 6 giờ 36 phút 5 giờ 42 phút 3 giờ 00 phút
Kết quả bảng 3.17 thể hiện rằng mẫu táo tây và khoai tây khi được xử lí với một số hóa chất như acid ascorbic, acid citric và NaCl đều có thời gian sẫm màu chậm hơn so với mẫu không được xử lí hóa chất, trong đó mẫu xử lí với acid ascorbic có thời gian sẫm màu chậm hơn các chất còn lại, vì vậy acid ascorbic có hiệu quả hơn trong việc điều khiển sự hóa nâu của rau quả và trái cây.
3.4. 4. Sử dụng enzyme
PPO có bản chất cấu tạo là protein nên có thể bị bất hoạt bởi các enzyme khác có khả năng phân giải phần protein của enzyme. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 2 protease là ficin từ sung và bromelin từ thơm để bất hoạt PPO. Phương pháp tách chiết enzyme ficin và bromelin được trình bày trong phần phụ lục mục 5.5 và phương pháp xác định hoạt độ của ficin và bromelin được trình bày trong phần phụ lục mục 5.6. Phương pháp sử dụng enzyme để kiềm chế sự hóa nâu được nêu trong mục 2.2.8 và kết quả thể hiện trong bảng 3.18.
Bảng 3.18. Kết quả ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của rau quả
Nguyên liệu
Mẫu không xử lí
Mẫu có xử lí (0,3 UI/gNL)
Ficin Bromelin
Thời gian sẫ m màu
Khoai tây 53 phút 3 giờ 21 phút 3 giờ 11 phút Táo tây 9 phút 5 giờ 36 phút 3 giờ 24 phút
Kết quả bảng 3.18 thể hiện rằng mẫu khi được xử lí với enzyme ficin và bromelin có thời gian sẫm màu chậm hơn mẫu không được xử lí nên có thể sử dụng enzyme protease có khả năng phân cắt phần protein của PPO để làm chậm sự sẫm màu của trái cây và rau củ khi cắt gọt, chế biến
3.5. Thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu
Chúng tôi tiến hành tách chiết PPO và tạo chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu lá trà xanh theo phương pháp được nêu trong mục 2.2.9 và kết quả được thể hiện trong bảng 3.19
Bảng 3.19. Kết quả thu nhận chế phẩm PPO thô từ lá trà nguyên liệu
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Trọng lượng nguyên liệu khô ban đầu (g) 11,22 11,24 11,20 Trọng lượng chế phẩm PPO thô (g) 0,7939 0,7941 0,7900
Tỉ lệ CPE/NL (%) 7,08 7,06 7,05
Tỉ lệ TB CPE/NL (%) 7,06 ± 0,01 2
Hoạt độ chung CPE (UI/gCPE) 2287,78 2268,86 2277,90 Hoạt độ chung TB CPE (UI/gCPE) 2278,18 ± 9, 46
Hàm lượng protein (mg/gCPE) 23,30 24,96 23,52 Hàm lượng protein TB (mg/gCPE) 23,93 ± 0,90
Hoạt độ riêng CPE (UI/mg Pr-E) 95,20
Kết quả bảng 3.19 thể hiện rằng chúng tôi đã thu nhận được chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu với tỉ lệ trung bình của chế phẩm enzyme thô/nguyên liệu khô là 7,06% và enzyme thể hiện hoạt độ chung trung bình là 2278,18 UI/gCPE và hoạt độ riêng là 95,20 UI/mg Pr-E. Chế phẩm PPO có hoạt độ riêng thấp hơn so với hoạt độ riêng của PPO trong nguyên liệu do PPO là enzyme oxi hóa khử dễ bị giảm hoạt độ trong quá trình tách chiết và sấy khô để tạo chế phẩm enzyme thô.
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
Từ những kết quả thu được trong luận văn đối chiếu với mục tiêu đã đề ra trong đề tài, chúng tôi rút ra một số kết luận sau đây: 4.1.1. Đã xác định các đặc tính của PPO từ lá trà như sau:
- Hoạt độ chung của PPO là 2222,64 UI/gNL và hoạt độ riêng 275,76 UI/mg-PrNL - pH tối ưu cho hoạt động của enzyme là 5,0
- Enzyme hoạt động ổn định ở pH tối ưu và kém bền ở pH 3,0 và pH 8,0 sau khi ủ trong thời gian 30 phút
- Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme là 30oC
- Enzyme hoạt động ổn định khi ủ ở 40oC và kém bền khi ủ trong khoảng nhiệt độ từ 60 oC – 80 oC trong 30 phút
- Nồng độ cơ chất (catechol) tối ưu cho hoạt động của enzyme là 50mM - Enzyme bị ức chế bởi một số hóa chất như acid ascorbic, acid citric, NaCl. Trong đó acid ascorbic ức chế hoạt động của PPO mạnh hơn acid citric và NaCl
- Thu được chế phẩm PPO thô từ lá trà với tỉ lệ trung bình của CPE thô/NL là 7,06% và enzyme thể hiện HđC TB là 2287,42 UI/gCPE và HđR là 95,20 UI/mg Pr-E
4.1.2. Ứng dụng được tính chất có lợi của enzyme PPO trong tạo màu cho sản phẩm trà đen do PPO xúc tác quá trình oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon tạo sẫm màu trong sản phẩm trà đen. Ngược lại trong quá trình chế biến trà xanh cần bất hoạt PPO bởi nhiệt độ cao nên không có sự hình thành màu đen và giữ được màu xanh và