Phương pháp nghiên cứu

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Trong các nghiên cứu về vi khuẩn khử sunphat, ta có thể dễ dàng quan sát sự sinh trưởng và phát triển của nhóm vi khuẩn này trong môi trường nuôi cấy dựa vào sự xuất hiện của cặn đen (FeS) trong môi trường dịch hay của các khuẩn lạc màu đen trong môi trường thạch. Đây là kết quả phản ứng giữa FeSO4 (chất thêm được cho vào môi trường) với khí H2S (sinh ra bởi vi khuẩn khuẩn khử sunphat).

2.2.1. Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của hỗn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt

Các mẫu vi khuẩn khử sunphat từ bộ sưu tập vi khuẩn khử sunphat lấy từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu được nuôi cấy hoạt hóa nhiều lần trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất cho đến khi vi khuẩn khử sunphat sinh trưởng tốt. Sau đó, các mẫu này sẽ được nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl và được bổ sung dầu thô (0,5%; 1%

và 3% môi trường) làm nguồn cơ chất duy nhất. Sự sinh trưởng của các vi khuẩn khử

sunphat này trờn dầu thụ đƣợc theo dừi hàng ngày trong 1 thỏng. Mẫu nào thấy cú sự sinh trưởng của vi khuẩn khử sunphat trên môi trường dầu thô thì chứng tỏ vi khuẩn khử sunphat của mẫu đó có khả năng sử dụng dầu thô làm nguồn cơ chất.

2.2.2. Đánh giá hàm lƣợng dầu tổng số bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt

Các mẫu vi khuẩn khử sunphat có khả năng sinh trưởng tốt trên cơ chất dầu thô (từ thí nghiệm 2.2.1) được cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các mẫu này đƣợc nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl và cơ chất dầu thô 1%.

Sau 4 tuần nuôi cấy, hàm lƣợng dầu tổng số và thành phần dầu thô bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat sẽ được xác định bằng phương pháp tách dầu trong nước:

Lọc mẫu nuôi cấy vi khuẩn khử sunphat trong môi trường chứa 1% dầu thô bằng giấy lọc. Dầu và các sản phẩm lơ lửng không tan trong nước được giữ trên giấy lọc. Giấy lọc sau đó đƣợc đƣợc rửa vài lần bằng cách nhúng trong cốc đựng chloroform và được thu hồi vào một cốc cân. Sau khi thực hiện xong bước này, phần lớn mẫu dầu sau thí nghiệm còn bám trên thành chai đựng mẫu. Vì vậy, tiến hành tráng rửa chai vài lần bằng chroroform và thu hồi vào cùng cốc cân nói trên. Để dung môi trong cốc cân bay hơi qua đêm ở điều kiện nhiệt độ 20oC. Sau khi bay hơi hết dung môi. Cân cốc cân để xác định khối lƣợng dầu.

2.2.3. Phân lập đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô

Các mẫu vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô cao (từ thí nghiệm 2.2.2) được cấy hoạt hóa trên môi trường môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các mẫu này đƣợc pha loãng đến các nồng độ thích hợp và nuôi cấy trên môi trường thạch khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với dầu thô (1%) là nguồn cơ chất duy nhất. Sự sinh trưởng của cỏc mẫu vi khuẩn khử sunphat này trờn mụi trường thạch được theo dừi hàng ngày trong 1 tháng. Các khuẩn lạc chiếm ƣu thế và các khuẩn lạc có hình thái khác nhau được tách riêng và cấy truyền trên môi trường dầu thô 1% để giữ giống và dùng trong

các nghiên cứu tiếp theo. Khi đó ta thu đƣợc các chủng thuần khiết (sau khi cấy lại trên môi trường thạch để kiểm tra độ sạch của chủng đã phân lập).

2.2.4. Nghiên cứu hình thái tế bào, nhuộm Gram và khả năng hình thành bào tử của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt

2.2.4.1. Nhuộm Gram

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trường môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1%. Khi các chủng này sinh trưởng tốt, tiến hành nhuộm Gram và quan sát trên kính hiển vi quang học. Chủng nào bắt màu xanh tím thì chủng đó thuộc nhóm Gram dương còn chủng nào bắt màu hồng tía thì chủng đó thuộc nhóm Gram âm.

2.2.4.2. Nghiên cứu khả năng hình thành bào tử bằng phương pháp sốc nhiệt Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô thuộc nhóm Gram dương được cấy hoạt hóa trên môi trường môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1%. Khi các chủng này sinh trưởng tốt, tiến hành sốc nhiệt ở 85oC trong vòng 20 phút, rồi nuôi cấy trở lại trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1%. Nếu chủng nào sinh trưởng trở lại được thì chủng đó có khả năng tạo bào tử.

2.2.4.3. Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Khi các chủng này sinh trưởng tốt, lọc bỏ cặn FeS rồi ly tâm 8000 vòng/phút ở 4oC để thu tế bào, rửa lại bằng PBS (Phosphate buffer saline) pH 7,2. Tế bào đƣợc cố định trong dung dịch glutaraldehyde 2,5% trong 15 phút. Sau đó, tế bào đƣợc đƣa lên bề mặt lamen. Lamen chứa tế bào đƣợc rửa 2 lần trong dung dịch PBS rồi đƣợc cố định

bằng dung dịch OsO4 trong 15 phút. Lamen lại đƣợc rửa bằng dung dịch PBS 2 lần rồi lần lượt đưa qua các dung dịch cồn 50%, 70%, 80%, 90% và 100% để hút nước tế bào.

Sau khi lamen khô, đƣợc phủ bằng Pt trong chân không rồi đƣa vào kính hiển vi điện tử HITACHI S4800 để quan sát tế bào.

2.2.5. Nghiên cứu khả năng chuyển hóa cơ chất của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất.. Sau đó, các chủng này được nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl có bổ sung lactat (1%) hoặc axetat (1%) để kiểm tra khả năng oxy hóa cơ chất hoàn toàn hay không hoàn toàn. Nếu trên cả hai môi trường lactat và axetat vi khuẩn đều sinh trưởng tốt, chứng tỏ chủng đó có khả năng oxy hóa hoàn toàn lactat thành CO2 và nước. Nếu chỉ quan sát thấy sự sinh trưởng trên môi trường lactat là nguồn cơ chất duy nhất, chứng tỏ chủng đó oxy hóa không hoàn toàn cơ chất.

2.2.6. Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt

3%; 5%; 10%; 20%; 30%). Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này trên dầu thụ đƣợc theo dừi hàng ngày trong 3 tuần và tiến hành lấy mẫu phõn tớch định kỳ sau 1, 4, 7, 10, 14, 21 ngày nuôi cấy. Các mẫu này đƣợc tiến hành xác định hàm lƣợng H2S tạo thành (phương pháp chuẩn độ iot). Ở hàm lượng dầu thô mà có hàm lượng H2S lớn nhất thì đó là hàm lượng dầu thô tối ưu cho sinh trưởng của chủng đó.

Xác định hàm lượng H2S bằng phương pháp chuẩn độ iot:

Lượng H2S do vi khuẩn khử sunphat sinh ra được xác định theo phương pháp chuẩn độ iot của Rezinhicop.

- Hút 25 ml dung dịch I2 0,1N vào bình để chuẩn (bình tam giác 250 ml).

- Hút 10 ml mẫu (dịch nuôi cấy) đã lắc đều cho vào bình để chuẩn.

- Cho vào bình chuẩn 1ml HCl 10%. Lắc đều trong bình chuẩn.

- Dùng dung dịch Na2S2O3 0,1N chuẩn cho đến khi dung dịch trong bình chuẩn có màu vàng nhạt thì cho 1ml dung dịch tinh bột 1% vào, chuẩn tiếp cho đến khi nào mất màu tím xanh thì thôi.

- Hàm lƣợng H2S sẽ đƣợc xác định theo công thức.

1 1 2 2 17000 /

H S

mau

V N V N V mg l

V1, V2: thể tích dung dịch iot, thể tích Na2S2O3. N1, N2: nồng độ iot, nồng độ Na2S2O3.

2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến quá trình sinh trưởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt

Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này ở các nồng độ muối khác nhau đƣợc theo dừi hàng ngày trong 3 tuần và tiến hành lấy mẫu phõn tớch định kỳ sau 1, 4, 7, 10, 14, 21 ngày nuôi cấy. Các mẫu này đƣợc tiến hành xác định hàm lƣợng H2S tạo thành (phương pháp chuẩn độ iot) (xem 2.2.6). Ở nồng độ muối mà có hàm lượng H2S lớn nhất thì đó là nồng độ muối tối ưu cho sinh trưởng của chủng đó.

2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này được nuôi cấy trong môi trường có hàm lượng dầu thô, nồng độ muối tối ưu cho quá trình sinh trưởng với các pH khác nhau (3, 5, 6, 7, 8, 10). Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này ở các pH khác nhau đƣợc theo dừi hàng ngày trong 3 tuần và tiến hành lấy mẫu phõn tớch định kỳ sau 1, 4, 7, 10, 14, 21 ngày nuôi cấy. Các mẫu này đƣợc tiến hành xác định hàm lƣợng H2S

tạo thành (phương pháp chuẩn độ iot) (xem 2.2.6). Ở pH mà có hàm lượng H2S lớn nhất thì đó là pH tối ưu cho sinh trưởng của chủng đó.

2.2.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này được nuôi cấy trong môi trường có hàm lượng dầu thô, nồng độ muối tối và pH tối ưu cho quá trình sinh trưởng ở các nhiệt độ khác nhau (30oC, 45oC, 55oC, 70oC). Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau đƣợc theo dừi hàng sau 5 ngày nuụi cấy. Quan sát định tính bằng mắt để xác định khoảng nhiệt độ sinh trưởng của đơn chủng khử sunphat (bằng cách quan sát có hay không có cặn kết tủa FeS).

Phƣơng pháp nghiên cứu

Đặc điểm hình thái tế bào