Trong các nghiên cứu về vi khuẩn khử sunphat, ta có thể dễ dàng quan sát sự sinh trƣởng và phát triển của nhóm vi khuẩn này trong môi trƣờng nuôi cấy dựa vào sự xuất hiện của cặn đen (FeS) trong môi trƣờng dịch hay của các khuẩn lạc màu đen trong môi trƣờng thạch. Đây là kết quả phản ứng giữa FeSO4 (chất thêm đƣợc cho vào môi trƣờng) với khí H2S (sinh ra bởi vi khuẩn khuẩn khử sunphat).
2.2.1. Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của hỗn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
Các mẫu vi khuẩn khử sunphat từ bộ sƣu tập vi khuẩn khử sunphat lấy từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu đƣợc nuôi cấy hoạt hóa nhiều lần trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất cho đến khi vi khuẩn khử sunphat sinh trƣởng tốt. Sau đó, các mẫu này sẽ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl và đƣợc bổ sung dầu thô (0,5%; 1% và 3% môi trƣờng) làm nguồn cơ chất duy nhất. Sự sinh trƣởng của các vi khuẩn khử
sunphat này trên dầu thô đƣợc theo dõi hàng ngày trong 1 tháng. Mẫu nào thấy có sự sinh trƣởng của vi khuẩn khử sunphat trên môi trƣờng dầu thô thì chứng tỏ vi khuẩn khử sunphat của mẫu đó có khả năng sử dụng dầu thô làm nguồn cơ chất.
2.2.2. Đánh giá hàm lƣợng dầu tổng số bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
Các mẫu vi khuẩn khử sunphat có khả năng sinh trƣởng tốt trên cơ chất dầu thô (từ thí nghiệm 2.2.1) đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các mẫu này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl và cơ chất dầu thô 1%. Sau 4 tuần nuôi cấy, hàm lƣợng dầu tổng số và thành phần dầu thô bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp tách dầu trong nƣớc:
Lọc mẫu nuôi cấy vi khuẩn khử sunphat trong môi trƣờng chứa 1% dầu thô bằng giấy lọc. Dầu và các sản phẩm lơ lửng không tan trong nƣớc đƣợc giữ trên giấy lọc. Giấy lọc sau đó đƣợc đƣợc rửa vài lần bằng cách nhúng trong cốc đựng chloroform và đƣợc thu hồi vào một cốc cân. Sau khi thực hiện xong bƣớc này, phần lớn mẫu dầu sau thí nghiệm còn bám trên thành chai đựng mẫu. Vì vậy, tiến hành tráng rửa chai vài lần bằng chroroform và thu hồi vào cùng cốc cân nói trên. Để dung môi trong cốc cân bay hơi qua đêm ở điều kiện nhiệt độ 20oC. Sau khi bay hơi hết dung môi. Cân cốc cân để xác định khối lƣợng dầu.
2.2.3. Phân lập đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô dầu thô
Các mẫu vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô cao (từ thí nghiệm 2.2.2) đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các mẫu này đƣợc pha loãng đến các nồng độ thích hợp và nuôi cấy trên môi trƣờng thạch khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với dầu thô (1%) là nguồn cơ chất duy nhất. Sự sinh trƣởng của các mẫu vi khuẩn khử sunphat này trên môi trƣờng thạch đƣợc theo dõi hàng ngày trong 1 tháng. Các khuẩn lạc chiếm ƣu thế và các khuẩn lạc có hình thái khác nhau đƣợc tách riêng và cấy truyền trên môi trƣờng dầu thô 1% để giữ giống và dùng trong
các nghiên cứu tiếp theo. Khi đó ta thu đƣợc các chủng thuần khiết (sau khi cấy lại trên môi trƣờng thạch để kiểm tra độ sạch của chủng đã phân lập).
2.2.4. Nghiên cứu hình thái tế bào, nhuộm Gram và khả năng hình thành bào tử của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
2.2.4.1. Nhuộm Gram
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1%. Khi các chủng này sinh trƣởng tốt, tiến hành nhuộm Gram và quan sát trên kính hiển vi quang học. Chủng nào bắt màu xanh tím thì chủng đó thuộc nhóm Gram dƣơng còn chủng nào bắt màu hồng tía thì chủng đó thuộc nhóm Gram âm.
2.2.4.2. Nghiên cứu khả năng hình thành bào tử bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô thuộc nhóm Gram dƣơng đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1%. Khi các chủng này sinh trƣởng tốt, tiến hành sốc nhiệt ở 85oC trong vòng 20 phút, rồi nuôi cấy trở lại trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1%. Nếu chủng nào sinh trƣởng trở lại đƣợc thì chủng đó có khả năng tạo bào tử.
2.2.4.3. Quan sát hình thái tế bào dƣới kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dầu thô 1%. Khi các chủng này sinh trƣởng tốt, lọc bỏ cặn FeS rồi ly tâm 8000 vòng/phút ở 4oC để thu tế bào, rửa lại bằng PBS (Phosphate buffer saline) pH 7,2. Tế bào đƣợc cố định trong dung dịch glutaraldehyde 2,5% trong 15 phút. Sau đó, tế bào đƣợc đƣa lên bề mặt lamen. Lamen chứa tế bào đƣợc rửa 2 lần trong dung dịch PBS rồi đƣợc cố định
bằng dung dịch OsO4 trong 15 phút. Lamen lại đƣợc rửa bằng dung dịch PBS 2 lần rồi lần lƣợt đƣa qua các dung dịch cồn 50%, 70%, 80%, 90% và 100% để hút nƣớc tế bào. Sau khi lamen khô, đƣợc phủ bằng Pt trong chân không rồi đƣa vào kính hiển vi điện tử HITACHI S4800 để quan sát tế bào.
2.2.5. Nghiên cứu khả năng chuyển hóa cơ chất của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt sunphat ƣa nhiệt
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất.. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl có bổ sung lactat (1%) hoặc axetat (1%) để kiểm tra khả năng oxy hóa cơ chất hoàn toàn hay không hoàn toàn. Nếu trên cả hai môi trƣờng lactat và axetat vi khuẩn đều sinh trƣởng tốt, chứng tỏ chủng đó có khả năng oxy hóa hoàn toàn lactat thành CO2 và nƣớc. Nếu chỉ quan sát thấy sự sinh trƣởng trên môi trƣờng lactat là nguồn cơ chất duy nhất, chứng tỏ chủng đó oxy hóa không hoàn toàn cơ chất.
2.2.6. Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt sunphat ƣa nhiệt
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên các môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl có bổ sung hàm lƣợng dầu thô khác nhau (0,5%; 1%; 3%; 5%; 10%; 20%; 30%). Sự sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này trên dầu thô đƣợc theo dõi hàng ngày trong 3 tuần và tiến hành lấy mẫu phân tích định kỳ sau 1, 4, 7, 10, 14, 21 ngày nuôi cấy. Các mẫu này đƣợc tiến hành xác định hàm lƣợng H2S tạo thành (phƣơng pháp chuẩn độ iot). Ở hàm lƣợng dầu thô mà có hàm lƣợng H2S lớn nhất thì đó là hàm lƣợng dầu thô tối ƣu cho sinh trƣởng của chủng đó.
Xác định hàm lượng H2S bằng phương pháp chuẩn độ iot:
Lƣợng H2S do vi khuẩn khử sunphat sinh ra đƣợc xác định theo phƣơng pháp chuẩn độ iot của Rezinhicop.
- Hút 10 ml mẫu (dịch nuôi cấy) đã lắc đều cho vào bình để chuẩn. - Cho vào bình chuẩn 1ml HCl 10%. Lắc đều trong bình chuẩn.
- Dùng dung dịch Na2S2O3 0,1N chuẩn cho đến khi dung dịch trong bình chuẩn có màu vàng nhạt thì cho 1ml dung dịch tinh bột 1% vào, chuẩn tiếp cho đến khi nào mất màu tím xanh thì thôi.
- Hàm lƣợng H2S sẽ đƣợc xác định theo công thức. 2 1 1 2 2 17000 / H S mau V N V N mg l V m V1, V2: thể tích dung dịch iot, thể tích Na2S2O3. N1, N2: nồng độ iot, nồng độ Na2S2O3.
2.2.7. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl đến quá trình sinh trƣởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy ở hàm lƣợng dầu tối ƣu trên các môi trƣờng với các nồng độ muối khác nhau (0%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%). Sự sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này ở các nồng độ muối khác nhau đƣợc theo dõi hàng ngày trong 3 tuần và tiến hành lấy mẫu phân tích định kỳ sau 1, 4, 7, 10, 14, 21 ngày nuôi cấy. Các mẫu này đƣợc tiến hành xác định hàm lƣợng H2S tạo thành (phƣơng pháp chuẩn độ iot) (xem 2.2.6). Ở nồng độ muối mà có hàm lƣợng H2S lớn nhất thì đó là nồng độ muối tối ƣu cho sinh trƣởng của chủng đó.
2.2.8. Nghiên cứu ảnh hƣởng của pH đến quá trình sinh trƣởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có hàm lƣợng dầu thô, nồng độ muối tối ƣu cho quá trình sinh trƣởng với các pH khác nhau (3, 5, 6, 7, 8, 10). Sự sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này ở các pH khác nhau đƣợc theo dõi hàng ngày trong 3 tuần và tiến hành lấy mẫu phân tích định kỳ sau 1, 4, 7, 10, 14, 21 ngày nuôi cấy. Các mẫu này đƣợc tiến hành xác định hàm lƣợng H2S
tạo thành (phƣơng pháp chuẩn độ iot) (xem 2.2.6). Ở pH mà có hàm lƣợng H2S lớn nhất thì đó là pH tối ƣu cho sinh trƣởng của chủng đó.
2.2.9. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trƣởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có hàm lƣợng dầu thô, nồng độ muối tối và pH tối ƣu cho quá trình sinh trƣởng ở các nhiệt độ khác nhau (30oC, 45oC, 55oC, 70oC). Sự sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này ở các nhiệt độ khác nhau đƣợc theo dõi hàng sau 5 ngày nuôi cấy. Quan sát định tính bằng mắt để xác định khoảng nhiệt độ sinh trƣởng của đơn chủng khử sunphat (bằng cách quan sát có hay không có cặn kết tủa FeS).
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt lấy từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu khoan dầu khí Vũng Tàu
Các mẫu vi khuẩn khử sunphat (hỗn chủng) lấy từ bộ sƣu tập của phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến bổ sung dầu thô với hàm lƣợng khác nhau (1, 3, 5%) là nguồn cơ chất duy nhất để thử nghiệm khả năng sử dụng dầu của chúng. Mẫu đƣợc nuôi ở nhiệt độ 55oC, quan sát sự sinh trƣởng hàng ngày trong vòng 1 tháng. Kết quả đƣợc ghi nhận tại các thời điểm 7, 14 và 30 ngày đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phụ lục.
Bảng 3.1. Khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt phân lập từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu
STT Tên mẫu
7 ngày 14 ngày 30 ngày Nồng độ dầu thô Nồng độ dầu thô Nồng độ dầu thô
0,5% 1% 3% 0,5% 1% 3% 0,5% 1% 3% 1 14G3 -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ 2 61G3 -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ 3 64G3 + + + + + + + + + 4 66G3 -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ 5 70G3 + + + + + + + + + 6 73G3 -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ 7 90G3 -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ 8 194G3 -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ 9 BC100m3G3 -+ -+ -+ -+ -+ -+ + + + 10 Đ88G4 + + + + + + + + + 11 BE - Đ88G4 -+ -+ -+ -+ -+ -+ + + + 12 100m3G5 + -+ -+ + -+ -+ + -+ -+ 13 BE100m3G6 -+ -+ -+ -+ -+ -+ + + + 14 110G6 + + + + + + + + + 15 702M + + + + + + + + + 16 ĐH G7 - -+ -+ + + + + + + 17 80G8 + + + + + + + + + 18 801G8 + + + + + + + + +
STT Tên mẫu
7 ngày 14 ngày 30 ngày Nồng độ dầu thô Nồng độ dầu thô Nồng độ dầu thô
0,5% 1% 3% 0,5% 1% 3% 0,5% 1% 3% 19 802G8 + + + + + + + + + 20 806G8 + + + + + + + + + 21 809G8 + + + + + + + + + 22 820G8 + + + + + + + + + 23 BC100m3G8 + + + + + + + + + 24 M 914 + + + + + + + + + 25 Đ 914 + + + + + + + + + 26 M 919 + + + + + + + + + 27 M 918 + + + + + + + + + 28 G920 -+ -+ -+ -+ -+ -+ + + + 29 920TP + + + + + + + + + 30 C1G9 + + + + + + + + + 31 C2G9 + + + + + + + + + 32 NC - 914 -+ -+ -+ -+ -+ -+ + + + 33 100m3G9 -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ 34 1008BT + + + + + + + + + 35 M1008G10 + + + + + + + + + 36 Đ1008G10 + + + + + + + + + 37 NCH-G10 -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ 38 NBG10 + + + + + + + + + 39 V10B - CTK3 + + + + + + + + +
(+: sinh trưởng tốt; -+: sinh trưởng yếu; -: không sinh trưởng)
Từ bảng 3.1 cho thấy 39 mẫu vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt lấy từ vị trí khác nhau của các giàn đều có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng nuôi cấy với dầu thô là nguồn cơ chất duy nhất, trong đó có 25 chủng thể hiện khả năng sinh trƣởng tốt. Kết quả trên đã cho thấy vi khuẩn khử sunphat sử dụng cơ dầu thô làm nguồn cơ chất là hiện tƣợng phổ biến. Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô [Aeckersberg và cs, 1991; Rueter và cs, 1994; Kniemeyer và cs, 2003; Cravo-Laureau và cs, 2004; Irea và cs, 2006]. Tuy nhiên ở Việt Nam chƣa có công trình nghiên cứu nào công bố về khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat. Do đó, với kết quả này, ta có thể thấy các chủng vi khuẩn
khử sunphat phân lập từ các giếng khoan dầu khí Vũng Tàu cũng có thể sử dụng dầu thô là nguồn cơ chất để sinh trƣởng. Những nghiên cứu trƣớc đây về vi khuẩn khử sunphat phân lập từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu chỉ sử dụng nguồn cơ chất ƣa thích là lactat và axetat [Lại Thúy Hiền và cs, 1998; Lại Thúy Hiền và cs, 2003]. Trong nghiên cứu này, ngay cả nguồn cơ chất kém ƣa thích là dầu thô cũng trở thành cơ chất mà vi khuẩn khử sunphat có thể sử dụng và sinh trƣởng tốt. Ngoài ra, nhóm vi khuẩn