1.4.1 Ảnh hƣởng đến sinh thái và môi trƣờng
Vi khuẩn khử sunphat là nhóm vi khuẩn phân bố khá rộng trong tự nhiên, đặc biệt ở những nơi có hàm lƣợng sunphat cao (28 mM) nhƣ trong nƣớc biển hay trong các trầm tích đáy ao, sông, biển. Đặc trƣng quan trọng nhất của vi khuẩn khử sunphat là tạo ra khí H2S trong quá trình sinh trƣởng, cũng chính điều này đã gây ảnh hƣởng không tốt cho hệ sinh thái có sự xuất hiện nhóm vi khuẩn này. H2S là chất khí có mùi
thối đặc trƣng, không những gây ra ô nhiễm về mùi mà nó còn ảnh hƣởng đến các sinh vật khác sống cùng hệ sinh thái đó. Thứ nhất, H2S tác động trực tiếp với oxy hòa tan trong nƣớc, làm giảm hàm lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc. Thứ hai, H2S gây độc đối với các động vật thủy sinh vì nó dễ dàng kết hợp với ion Fe trong hemoglobin (H2S + FeO FeS + H2O), dẫn đến giảm khả năng vận chuyển ôxy của hemoglobin làm chúng bị ngạt [Nguyễn Thanh Phƣơng và cs, 2009].
Tuy nhiên, khi đặt vi khuẩn khử sunphat trong khía cạnh sinh thái, ta cũng không thể không nói đến tầm quan trọng của chúng. Vi khuẩn khử sunphat đóng vai trò không thể thiếu trong các chu trình địa chất của lƣu huỳnh và carbon hay trong quá trình hình thành các mỏ dầu [Sievert và cs, 2007]. Trong các hệ sinh thái kị khí, vi khuẩn khử sunphat cũng là một nhân tố trong chuỗi thức ăn, cùng với các nhóm vi khuẩn khác góp phần chuyển hóa hoàn toàn các hợp chất hữu cơ thành CO2 và nƣớc [Gibson, 1990].
Bên cạnh đó, với khả năng khử các ion kim loại nặng trong môi trƣờng, vi khuẩn khử sunphat đang đƣợc coi nhƣ là một tác nhân xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Trên thế giới, bắt đầu từ năm 1998, phƣơng pháp loại bỏ kim loại nặng trong nƣớc thải bằng vi khuẩn khử sunphat đã đƣợc nghiên cứu, ứng dụng để làm sạch các ion và thu hồi các kim loại nặng. Ở Việt Nam, những nghiên cứu nhƣ thế mới chỉ bắt đầu. Nhóm nghiên cứu của Đặng Phƣơng Nga (2007) đã có những nghiên cứu và mô tả chi tiết về khả năng chống chịu một số kim loại nặng (Cr6+
, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+) của một số chủng vi khuẩn khử sunphat phân lập tại các làng nghề, cơ sở sản xuất cơ khí (Vân Chàng - Nam Định). Kết quả cho thấy các vi khuẩn này chủ yếu thuộc về chi
Desulfovibiro. Cùng với những những nghiên cứu trong hơn 15 năm qua về khả năng sử dụng hydrocarbon dầu thô nhƣ đã đề cập ở mục (1.3.4) thì vi khuẩn khử sunphat còn đang mở ra một hƣớng đi mới cho việc xử lý ô nhiễm dầu bằng phƣơng pháp thu gom và xử lý trong điều kiện kị khí.
1.4.2. Ảnh hƣởng đến kinh tế và con ngƣời
Vi khuẩn khử sunphat trong quá trình sống cũng gây nên những rắc rối và thiệt hại không nhỏ đến đời sống, ngành nông nghiệp và công nghiệp của con ngƣời. Trong
nông nghiệp, vi khuẩn khử sunphat gây thối rễ bèo, rễ lúa, làm cho thủy sản chết hàng loạt, gây thiệt hại lớn cho nông dân và Nhà nƣớc. Trong công nghiệp, nhóm vi khuẩn này cũng gây ảnh hƣởng xấu đến các ngành công nghiệp giấy, gây nhiễm bẩn khí gas, là một trong những tác nhân gây hƣ hỏng thực phẩm (chi sinh bào tử
Desulfotomaculum)… [Gibson, 1990].
Đặc biệt, nhóm vi khuẩn này gây thiệt hại đáng kể đối với ngành công nghiệp dầu khí. Việc sinh ra khí H2S trong quá trình sinh trƣởng phát triển đã gây những tác hại khá to lớn đến ngành công nghiệp này. Theo các nhà khoa học, trong các giếng khoan có nhiệt độ lớn hơn 100oC thì khí H2S có nguồn gốc hóa học thuần túy, tuy nhiên, ở nhiệt độ dƣới 100o
C thì khí H2S rõ ràng có nguồn gốc từ vi khuẩn khử sunphat [Orr, 1974]. Khí H2S gây ra 4 tác động tiêu cực sau [Rabus và cs, 1996]:
(1) Gây ngộ độc cho công nhân làm việc tại các giếng khoan do tính chất gây độc khí này. Khí hydro sunphua với tỷ trọng 1,1895 nặng hơn không khí, do đó khí này luôn tập trung quanh khu vực xuất hiện khí với mật độ dày. H2S là chất khí cực độc (độc tính ngang với HCN và cao hơn CO từ 5 đến 6 lần). Ngƣời lao động khi làm việc trong môi trƣờng có khí H2S, có thể quen với mùi và không nhận ra sự tồn tại của nó dẫn đến những nguy hại về sau. Với hàm lƣợng thấp, khí H2S gây ảnh hƣởng đến đƣờng hô hấp, niêm mạc và giác mạc. Với hàm lƣợng cao, H2S làm tê liệt thần kinh khứu giác và có thể dẫn đến tử vong.
(2) Làm ô nhiễm dầu và khí đốt, làm tăng hàm lƣợng lƣu huỳnh chứa trong dầu thành phẩm và đồng thời gây mùi thối cho dầu.
(3) Chuyển đổi các khoáng sắt có trong dầu thành FeS, gây khó khăn cho việc tách dầu sau này.
(4) Gây ăn mòn đƣờng ống dẫn và các thiết bị chứa dầu do kết hợp với ion sắt trong các thiết bị. Đây chính là mối quan tâm hàng đầu của các kỹ sƣ dầu khí và nhà nghiên cứu. Hàng năm, Mỹ đã phải tổn thất từ 1 đến 2 tỷ USD do ăn mòn kim loại gây nên bởi vi khuẩn khử sunphat. Tại Việt Nam, vấn đề này cũng đang đƣợc ngành dầu khí Việt Nam rất quan tâm. Trong một nghiên cứu của Lại Thúy Hiền và Lê Phi
Nga (1992) với loài Desulfovibiro vulgaris phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ đã chỉ ra rằng tốc độ ăn mòn đƣờng ống của vi khuẩn này lên đến 0,062 - 0,085 mg/cm2
/ngày.
Do thiệt hại của vi khuẩn khử sunphat gây ra đối với ngành công nghiệp dầu khí nên việc kiểm soát số lƣợng và kìm hãm sự sinh trƣởng của vi khuẩn này trong các giếng khoan, hệ thống bể chứa và đƣờng ống là cần thiết. Đây cũng là mục tiêu của một trong những hợp đồng giữa Phòng Vi sinh vật dầu mỏ - Viện Công nghệ sinh học và xí nghiệp liên doanh Vietsopetro từ năm 1993 đến nay. Các nghiên cứu của Lại Thúy Hiền và cộng sự đã cho thấy nguồn gốc của vi khuẩn khử sunphat trong các giếng khoan dầu khí Việt Nam có nguồn gốc nội tại và cả ngoại lai xâm nhập vào giếng theo quá trình bơm ép nƣớc vào vỉa để duy trì áp suất khai thác dầu. Số lƣợng vi khuẩn khử sunphat ở các giếng bơm ép nƣớc lên tới 104 - 106 tế bào/ml và 0 - 102 tế bào ở các giếng khai thác [Lại Thúy Hiền và cs, 2000]. Kết quả thí nghiệm với một số chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt cho thấy chúng có thể tồn tại trong điều kiện vỉa có nhiệt độ cao, áp suất cao và là nguồn gốc chính tạo H2S trong các giếng khoan mỏ Bạch Hổ, Vũng Tàu [Lại Thúy Hiền và cs, 2001].
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu 2.1.1. Nguyên liệu 2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu vi khuẩn khử sunphat (hỗn chủng) thuộc bộ sƣu tập vi khuẩn khử sunphat đƣợc lấy từ các giàn khoan dầu khí Vũng Tàu của Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Dầu thô dùng cho quá trình nghiên cứu đƣợc lấy từ nguồn mỏ Bạch Hổ, nhận từ Xí nghiệp khai thác dầu khí Vietsopetro.
2.1. 2. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến(/l)
1. KH2PO4 2. NH4Cl 3. KCl 5. CaCl2 0,5 g 1 g 0,5 g 0,1 g 6. Na2SO4 7. MgSO4 6. NaCl 8. Nƣớc biển 1 g 2 g
Bổ sung tùy theo mục đích thí nghiệm Bổ sung tùy theo mục đích thí nghiệm pH môi trƣờng 7- 7,2.
Chất thêm: từ dung dịch gốc pha vào môi trƣờng để đạt tới nồng độ (/l). 1. FeSO4 3. Thioglicolat 4. Cao men 5. Vi lƣợng 0,5 g 0,1 g 0,5 g 1ml dung dịch gốc 6. Vitamin C 7. Vitamin 8. Na2S 2.5% 0,2 g 1 ml dung dịch gốc 0,05 ml Thành phần dung dịch vi lƣợng gốc (/l): 1. HCl 25% 2. FeSO4.7H2O 3. ZnSO4. 7H2O 4. MnCl2.4H2O 5. H3BO3 12,5 ml 2,1 g 0,144 g 0,1 g 0,03 g 6. CoCl2. 6H2O 7. CuCl2. 2H2O 8. NiCl2. 6H2O 9. Na2MoO4. 2H2O 0,19 g 0,002 g 0,024 g 0,036 g
Thành phần dung dịch vitamin gốc (/l): 1. Biotin 2. Axit Folic 3. Thiamin 4. Riboflavin 5. Pyridoxin 6. Cyanocobalamin 2 g 2 g 5 g 5 g 15 g 5 g 7. Axit Nicotin 8. Axit 4- aminobezoic 9. Axit Lipoic 10. Dung dịch đệm phosphat (10 mM, pH 7.1) 10 g 4 g 5 g 100 ml
Môi trƣờng đƣợc phân phối vào các bình tam giác vô trùng và khử trùng ở 0,8 at trong 45 phút. Trƣớc khi nuôi cấy, môi trƣờng đƣợc đun sôi và làm lạnh nhanh để hạn chế tối đa lƣợng oxy hòa tan. Cơ chất đƣợc thêm vào có thể là lactat (3,5 g/l), axetat (3 g/l) hoặc dầu thô tùy theo mục đích thí nghiệm. Để tách khuẩn lạc, môi trƣờng đƣợc bổ sung thêm vào môi trƣờng 12 g/l thạch. Chất thêm đƣợc thêm vào môi trƣờng trƣớc khi cấy tuỳ theo mục đích thí nghiệm. pH môi trƣờng đƣợc điều chỉnh bằng dung dịch NaHCO3 tới pH thích hợp với mục đích thí nghiệm.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong các nghiên cứu về vi khuẩn khử sunphat, ta có thể dễ dàng quan sát sự sinh trƣởng và phát triển của nhóm vi khuẩn này trong môi trƣờng nuôi cấy dựa vào sự xuất hiện của cặn đen (FeS) trong môi trƣờng dịch hay của các khuẩn lạc màu đen trong môi trƣờng thạch. Đây là kết quả phản ứng giữa FeSO4 (chất thêm đƣợc cho vào môi trƣờng) với khí H2S (sinh ra bởi vi khuẩn khuẩn khử sunphat).
2.2.1. Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của hỗn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
Các mẫu vi khuẩn khử sunphat từ bộ sƣu tập vi khuẩn khử sunphat lấy từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu đƣợc nuôi cấy hoạt hóa nhiều lần trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất cho đến khi vi khuẩn khử sunphat sinh trƣởng tốt. Sau đó, các mẫu này sẽ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl và đƣợc bổ sung dầu thô (0,5%; 1% và 3% môi trƣờng) làm nguồn cơ chất duy nhất. Sự sinh trƣởng của các vi khuẩn khử
sunphat này trên dầu thô đƣợc theo dõi hàng ngày trong 1 tháng. Mẫu nào thấy có sự sinh trƣởng của vi khuẩn khử sunphat trên môi trƣờng dầu thô thì chứng tỏ vi khuẩn khử sunphat của mẫu đó có khả năng sử dụng dầu thô làm nguồn cơ chất.
2.2.2. Đánh giá hàm lƣợng dầu tổng số bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
Các mẫu vi khuẩn khử sunphat có khả năng sinh trƣởng tốt trên cơ chất dầu thô (từ thí nghiệm 2.2.1) đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các mẫu này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl và cơ chất dầu thô 1%. Sau 4 tuần nuôi cấy, hàm lƣợng dầu tổng số và thành phần dầu thô bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp tách dầu trong nƣớc:
Lọc mẫu nuôi cấy vi khuẩn khử sunphat trong môi trƣờng chứa 1% dầu thô bằng giấy lọc. Dầu và các sản phẩm lơ lửng không tan trong nƣớc đƣợc giữ trên giấy lọc. Giấy lọc sau đó đƣợc đƣợc rửa vài lần bằng cách nhúng trong cốc đựng chloroform và đƣợc thu hồi vào một cốc cân. Sau khi thực hiện xong bƣớc này, phần lớn mẫu dầu sau thí nghiệm còn bám trên thành chai đựng mẫu. Vì vậy, tiến hành tráng rửa chai vài lần bằng chroroform và thu hồi vào cùng cốc cân nói trên. Để dung môi trong cốc cân bay hơi qua đêm ở điều kiện nhiệt độ 20oC. Sau khi bay hơi hết dung môi. Cân cốc cân để xác định khối lƣợng dầu.
2.2.3. Phân lập đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô dầu thô
Các mẫu vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô cao (từ thí nghiệm 2.2.2) đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các mẫu này đƣợc pha loãng đến các nồng độ thích hợp và nuôi cấy trên môi trƣờng thạch khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với dầu thô (1%) là nguồn cơ chất duy nhất. Sự sinh trƣởng của các mẫu vi khuẩn khử sunphat này trên môi trƣờng thạch đƣợc theo dõi hàng ngày trong 1 tháng. Các khuẩn lạc chiếm ƣu thế và các khuẩn lạc có hình thái khác nhau đƣợc tách riêng và cấy truyền trên môi trƣờng dầu thô 1% để giữ giống và dùng trong
các nghiên cứu tiếp theo. Khi đó ta thu đƣợc các chủng thuần khiết (sau khi cấy lại trên môi trƣờng thạch để kiểm tra độ sạch của chủng đã phân lập).
2.2.4. Nghiên cứu hình thái tế bào, nhuộm Gram và khả năng hình thành bào tử của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
2.2.4.1. Nhuộm Gram
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1%. Khi các chủng này sinh trƣởng tốt, tiến hành nhuộm Gram và quan sát trên kính hiển vi quang học. Chủng nào bắt màu xanh tím thì chủng đó thuộc nhóm Gram dƣơng còn chủng nào bắt màu hồng tía thì chủng đó thuộc nhóm Gram âm.
2.2.4.2. Nghiên cứu khả năng hình thành bào tử bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô thuộc nhóm Gram dƣơng đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1%. Khi các chủng này sinh trƣởng tốt, tiến hành sốc nhiệt ở 85oC trong vòng 20 phút, rồi nuôi cấy trở lại trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1%. Nếu chủng nào sinh trƣởng trở lại đƣợc thì chủng đó có khả năng tạo bào tử.
2.2.4.3. Quan sát hình thái tế bào dƣới kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dầu thô 1%. Khi các chủng này sinh trƣởng tốt, lọc bỏ cặn FeS rồi ly tâm 8000 vòng/phút ở 4oC để thu tế bào, rửa lại bằng PBS (Phosphate buffer saline) pH 7,2. Tế bào đƣợc cố định trong dung dịch glutaraldehyde 2,5% trong 15 phút. Sau đó, tế bào đƣợc đƣa lên bề mặt lamen. Lamen chứa tế bào đƣợc rửa 2 lần trong dung dịch PBS rồi đƣợc cố định
bằng dung dịch OsO4 trong 15 phút. Lamen lại đƣợc rửa bằng dung dịch PBS 2 lần rồi lần lƣợt đƣa qua các dung dịch cồn 50%, 70%, 80%, 90% và 100% để hút nƣớc tế bào. Sau khi lamen khô, đƣợc phủ bằng Pt trong chân không rồi đƣa vào kính hiển vi điện tử HITACHI S4800 để quan sát tế bào.
2.2.5. Nghiên cứu khả năng chuyển hóa cơ chất của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt sunphat ƣa nhiệt
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt hóa trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất.. Sau đó, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl có bổ sung lactat (1%) hoặc axetat (1%) để kiểm tra khả năng oxy hóa cơ chất hoàn toàn hay không hoàn toàn. Nếu trên cả hai môi trƣờng lactat và axetat vi khuẩn đều sinh trƣởng tốt, chứng tỏ chủng đó có khả năng oxy hóa hoàn toàn lactat thành CO2 và nƣớc. Nếu chỉ quan sát thấy sự sinh trƣởng trên môi trƣờng lactat là nguồn cơ chất duy nhất, chứng tỏ chủng đó oxy hóa không hoàn toàn cơ chất.
2.2.6. Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt sunphat ƣa nhiệt
Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô đƣợc cấy hoạt