Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5 Phương pháp nghiên cứu
2.5.4 Định danh các dòng nấm men có hoạt lực cao
Các bước tiến hành: Dùng phương pháp CTAB – PCI.
Huyền dịch chứa tế bào nấm men được nuôi tăng sinh ở môi trường Hansen lỏng (300C, 24 giờ). Sau đú, tiến hành thu sinh khối và tỏi huyền phự trong 500 àl đệm tách chiết CTAB (200-mM Tris–HCl (pH 8,0), 25-mM EDTA (pH 8,0), 250-M NaCl, 10% CTAB). Chuyển tất cả huyền dịch sang ống mới và bổ sung 200 àl SDS 20%, 3 àl proteinase K, 3 àl RNase trộn đều và ủ 1 giờ ở 37°C. Sau đú tiếp tục ủ 10 phỳt ở 65°C trong bể ổn nhiệt. Bổ sung một thể tích phenol: chloroform: isoamine alcohol (25:24:1) đảo nhẹ trong 5 phút và ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút (lặp lại hai lần), thu pha lỏng phía trên được chuyển sang ống mới. DNA sẽ được kết tủa bằng một thể tích isopropanol lạnh ở - 20°C trong 2 giờ. Thu kết tủa bằng ly tâm 14.000 vòng/
phút trong 5 phút và rửa lại với ethanol 700 (lặp lại 2 lần). Kết tủa sẽ được làm khô ở nhiệt độ phũng và hũa tan trong 100 àl nước cất [62].
Chất lượng của DNA được kiểm tra bằng điện di Agarose 1% và đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm trên máy NanoDrop [31].
Khuếch đại đoạn DNA bằng phản ứng PCA:
Thành phần phản ứng PCR gồm: (30 àl) MgCl2: 1 àl
dNTP: 0,5 àl Taq (1250 UI): 0,1 àl
Buffer 5X : 6 àl
DNA: 1 àl
DW: 21,4 àl
Chu trình nhiệt cho phản ứng: biến tính ở 950C trong 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ (950C trong 1 phút, 550C trong 30 giây và 720C trong 1 phút); 720C trong 10 phút và 40C để bảo quản [31].
Sản phẩm PCR sau đó được gửi sang công ty Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự. Sử dụng phần mềm MEGA 7,0 để so sánh trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh dòng loại của dòng nấm men tuyển chọn với các dòng nấm men có trên GenBank.
Sử dụng phương pháp loại trừ để chọn ra tỷ lệ phối trộn bánh men và tỷ lệ bổ sung chủng nấm men thích hợp cho quá trình lên men có khả năng sản xuất rượu tốt nhất.
Quy trình sản xuất rượu men lá dự kiến:
Hình 2.2. Quy trình sản xuất rượu men lá
Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu:
+ Nguyên liệu gạo Khang Dân được mua của người dân ở xã Phú Mỹ, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế. Yêu cầu gạo không bị mốc, không có mùi lạ, lượng tạp chất nhỏ.
+ Bánh men lá: mua của người dân tại xã Ba Nang, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị.
Gạo
Vo sạch
Nấu chín Làm nguội (30 - 32oC)
Trộn men Ủ (đường hóa)
(30 - 32oC)
Lên men Chưng cất
Rượu men lá
Bánh men lá
Nghiền mịn
Vo sạch gạo: mục đích để làm sạch các tạp chất (vỏ trấu, đầu hạt thóc…), bụi bẩn, loại bỏ lớp cám bám trên bề mặt gạo để làm giảm lượng dầu cám có trong rượu thành phẩm. Vo khoảng 3 - 4 lần, đến khi nào thấy nước vo gạo trong là được.
Nấu: mục đích để làm chín gạo, mềm gạo, còn gọi là quá trình hồ hóa tinh bột để tạo môi trường thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Yêu cầu là cơm phải chín đều, mềm và không bị sống, không được quá khô hay quá ướt, không bị vón cục và kết dính vào nhau. Tỷ lệ gạo: nước khoảng 1:1,2.
Làm nguội: cơm sau khi nấu chín thì cần phải làm tơi cơm và làm nguội đến nhiệt độ khoảng 30 - 32oC [22]. Vì đó là nhiệt độ thích hợp để cho nấm mốc, nấm men sống và phát triển, nếu nhiệt độ cao quá thì hệ vi sinh vật trong bánh men sẽ bị tiêu diệt, khi đó quá trình lên men không còn ý nghĩa.
Trộn men: cơm sau khi đã được làm nguội đến nhiệt độ 30 - 32oC, bánh men đã được nghiền mịn và dùng rây để tách bớt tạo chất (trấu) thì ta tiến hành trộn cơm và bánh men với nhau theo tỷ lệ thích hợp. Quá trình trộn cần phải thực hiện đều tay để nguyên liệu phân bố đều vào nhau, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển, quá trình đường hóa được diễn ra đồng đều và hiệu quả.
Ủ cơm: sau khi phối trộn xong thì ta cho cơm vào thùng hoặc hũ nhựa, duy trì nhiệt độ 30 - 32oC để nấm mốc phát triển [20], chuyển hóa tinh bột thành đường nhờ enzyme amylase của nấm mốc tiết ra. Ủ đến khi dùng tay ấn vào cơm thấy có nước thoát ra, cơm ăn có vị ngọt mạnh, tan nhanh trong miệng là được.
Lên men: sau khi ủ đã đạt yêu cầu thì ta cho nước vào, nước phải đạt chỉ tiêu an toàn thực phẩm, lượng nước cho vào là khoảng 2 lít/1kg gạo. Ở giai đoạn này các yếu tố nhiệt độ và thời gian lên men được khảo sát để chọn ra được nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình lên men. Nhiệt độ được khảo sát là: 25oC, 30oC, 35oC và ĐC (nhiệt độ môi trường) [20], [22] và với các thời gian lên men là: 6 ngày, 9 ngày, 12 ngày, 15 ngày, 18 ngày và 21 ngày. Nấm men sẽ chuyển hóa đường thành rượu etylic và một số sản phẩm phụ như metanol, aldehyde, acid, glycerin…
Chưng cất: kết thúc quá trình lên men, tiến hành chưng cất bằng hệ thống chưng cất rượu để thu được rượu men lá thành phẩm.