2.4.1 Các phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase in vitro
Nguyên tắc chung của phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme XO là so sánh hoạt tính enzyme XO trong môi trường có và không có mẫu thử. Hoạt tính enzyme được xác định theo nguyên tắc dựa vào sự giảm của các tác nhân oxy hóa thích hợp như oxy, xanh methylene, cytochrome, hoặc dựa vào sự giảm của cơ chất hay sự tạo thành của sản phẩm như acid uric bằng các phương pháp như đo quang phổ, huỳnh quang và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang.
2.4.1.1 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế xanthine oxidase in vitro bằng phương pháp quang phổ
- Phương pháp quang phổ dựa trên định lượng acid uric tạo ra Nguyên tắc chung: Hoạt tính của enzyme XO được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành theo phản ứng:
15
Xanthine + O2 + H2O XO
Acid uric + H2O2 Lượng acid uric tạo thành được định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 290 nm ở 25°C hoặc 37°C, pH=7,5 hoặc 8,0.
Hỗn hợp phản ứng gồm dung dịch đệm, dung dịch Ethylenediaminetetraacetic acid, dung dịch xanthine và enzyme XO. Các mẫu đối chứng được cho vào thêm dung dịch AP với các nồng độ khác nhau. Các mẫu thử được cho vào thêm cao thảo dược ở các nồng độ khác nhau. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ thích hợp, trong thời gian thích hợp. Sau khi phản ứng kết thúc, đem các hỗn hợp đo mật độ quang ở bước sóng 290 nm (Noro et al., 1983).
Đây là phương pháp dễ thực hiện, độ chính xác khá cao được nhiều nhà nghiên cứu thực hiện. Thí nghiệm thường được tiến hành trên ống nghiệm, sử dụng máy quang phổ UV thông thường. Tuy nhiên, cách này chỉ phù hợp với số lượng mẫu đo không quá nhiều. Khi số lượng mẫu thử quá lớn, việc tiến hành thử từng mẫu trên ống nghiệm sẽ có nguy cơ gặp sai số do sai khác về điều kiện phản ứng giữa các lần đo, đồng thời bị hạn chế do thời gian nghiên cứu kéo dài và chi phí cao. Có thể tiến hành thí nghiệm trên đĩa UV 96 giếng, sử dụng hệ thống ELISA để giảm sai số, rút ngắn thời gian nghiên cứu và giảm chi phí (Nguyen et al., 2004)
- Phương pháp quang phổ dựa trên chất ABTS (2,2’-azino-di (3ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))
Nguyên tắc chung: Hoạt tính của enzyme XO được xác định thông qua lượng ABTS dạng oxy hóa tạo thành theo các phản ứng:
Hypoxanthine + 2H2O + 2O2 Acid uric + O2
H2O2 + ABTSred
Hoạt tính của enzyme XO được xác định thông qua việc đo độ hấp thu quang phổ của ABTS tạo thành sau 10 phút ở bước sóng 410 nm.
Phương pháp quang phổ dựa trên chất ABTS có độ nhạy cao, có thể định lượng được hoạt tính lên tới 20 U/mL. Vì vậy, phương pháp này còn được áp dụng để định lượng hoạt tính enzyme trong cả nghiên cứu in vivo, tránh được sai số do enzyme uricase so với phương pháp quang phổ dựa trên định lượng acid uric. Tuy nhiên, chi phí của phương pháp này cao hơn và các bước thí nghiệm phức tạp hơn so với phương pháp quang phổ dựa trên định lượng acid uric (Maijkic,1987).
16
2.4.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên phản ứng oxy hóa 2-amino-4- hydroxypteridin thành isoxanthopterin dưới sự xúc tác của enzyme XO. Lượng isoxanthopterin tạo ra tỷ lệ với hoạt tính enzyme XO được phân tách qua cột sắc ký và được phát hiện, định lượng bằng đầu dò huỳnh quang với bước sóng kích thích và bước sóng phát hiện tương ứng là 343 nm và 410 nm (Sasaoka et al., 1998). Đây là phương pháp hiện đại, độ chính xác cao, nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, chi phí cao.
2.4.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất ức chế đến nồng độ acid uric trong cơ thể động vật
Mô hình gây tăng cấp acid uric trong máu chuột bằng kali oxonate được các nhà nghiên cứu sử dụng rất phổ biến để đánh giá tác dụng hạ acid uric của thuốc.
Kali oxonate là chất ức chế enzyme uricase. Enzyme uricase có vai trò chuyển hóa acid uric thành allantoin để thải ra ngoài qua thận (Stavric et al., 1975;
Stavric and Nera, 1978). Kali oxonate được tiêm vào màng bụng chuột bạch với liều 250 mg/kg cho thấy hiệu quả tăng acid uric trong máu rõ rệt (Kong et al., 2004; Mo et al., 2007). Nồng độ acid uric đạt đỉnh tại thời điểm hai giờ sau khi tiêm và tiếp đó giảm dần, đến giờ thứ tám thì trở về gần như bình thường (Nguyen et al.,2005).
Bên cạnh việc khảo sát nồng độ acid uric trong máu, mức độ ảnh hưởng của chất ức chế lên enzyme XO gan động vật thí nghiệm cũng được quan tâm nghiên cứu. Động vật thí nghiệm được dùng chất ức chế. Sau một thời gian, enzyme trong gan được phân lập, xác định hoạt tính để đánh giá mức độ ảnh hưởng của chất ức chế lên enzyme XO (Kong et al., 2004; Nguyen et al., 2005; Nguyễn Thùy Dương và ctv., 2011b). Năm 2010, Mohammad et al. đã đưa ra mô hình sàng lọc và đánh giá hoạt tính ức chế enzyme XO của các hoạt chất tiềm năng hoặc dịch chiết thảo dược thông qua việc sử dụng chất đối chiếu AP ở các nồng độ và mức độ ức chế enzyme XO được xác định gián tiếp thông qua định lượng nồng độ chất đánh dấu hóa học thay thế 6-mercaptopurin trong máu (Mohammad et al., 2010).
17