CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.3 Phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase53
a. Điều chế các cao phân đoạn
Nguyên tắc: Dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung bình hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh.
Tiến hành: Cao tổng của cây cỏ xước được hòa tan trở lại với nước (100 g cao trong 200 mL nước) trong bình chiết. Tiến hành chiết lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexane, ethyl acetate và n-butanol (Hình 3.5), phần dịch còn lại sau khi chiết với các dung môi gọi là phân đoạn nước. Phần dịch chiết của từng phân đoạn được cô cạn bằng máy cô quay chân không cho ra các cao tương ứng, với phân đoạn nước được tiến hành đông khô chân không để thu được cao nước. Các cao phân đoạn này được trữ ở 4°C để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. Toàn bộ quá trình chiết xuất được mô tả ở Hình 3.6.
Hình 3.6: Quá trình chiết lỏng-lỏng các cao phân đoạn 53
Hình 3.7: Sơ đồ tóm tắt quá trình điều chế cao các phân đoạn cây cỏ xước.
b. Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của các cao phân đoạn: được thực hiện tương tự cao tổng (đã trình bày ở mục 3.2.2.2).
Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất ức chế enzyme XO của từng phân đoạn và chỉ số IC50 của từng phân đoạn (cách tính đã trình bày ở mục 3.2.2.2).
Phân đoạn ethyl acetate có khả năng ức chế enzyme XO mạnh nhất và được sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3.2 Thí nghiệm 2: Phân lập các chất từ cao phân đoạn ethyl acetate Sau khi khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của các cao phân đoạn được chiết từ cỏ xước, phân đoạn ethyl acetate có hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh nhất được chọn để phân lập chất tinh khiết bằng phương pháp sắc ký cột (silica gel) (Hình 3.7). Các phân đoạn nhỏ hơn thu được trong quá trình sắc ký cũng được khảo sát khả năng ức chế enzyme XO để tìm phân đoạn có khả năng ức chế enzyme XO mạnh và tiếp tục tinh sạch chất. Sắc ký lớp mỏng và hiện vết bằng dung dịch vanillin/H2SO4 20% và dung dịch Fe3+ được sử dụng hỗ trợ trong quá trình phân lập chất.
54
Hình 3.8: Sắc ký cột phân đoạn ethyl acetate
Các hợp chất tinh khiết sau khi được phân lập sẽ được khảo sát khả năng ức chế enzyme XO. Cách làm tương tự như khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao tổng ethanol (đã trình bày ở mục 3.2.2.2). Tính được IC50 của mỗi chất.
Chất có hoạt tính ức chế mạnh enzyme XO được tiếp tục xác định kiểu ức chế.
Chất tinh khiết đã phân lập được tiến hành xác định cấu trúc phân tử của hợp chất. Cấu trúc phân tử hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm như: HMBC, DEPT, 1D- và 2D-NMR kết hợp với các tài liệu tham khảo đã công bố.
Các thông số kỹ thuật khi thực hiện kỹ thuật phân tích phổ NMR:
- Tên máy: Bruker avance III 500 Mhz - Tần số máy ghi phổ 1H-NMR: 500 MHz.
- Tần số máy ghi phổ 13C-NMR: 125 MHz.
- Số lần quét (Number scan – NS): dao động từ 16 – 128 lần.
Phương pháp phân tích phổ NMR bao gồm các bước như sau:
- Bước 1: Xác định công thức phân tử của chất cần nghiên cứu dựa trên dữ liệu phổ khối.
- Bước 2: Xác định số nối đôi của chất cần nghiên cứu dựa trên công thức phân tử.
- Bước 3: Nhận biết một số nhóm chức dựa trên dữ liệu FT-IR (Fourier Transform - infrared).
- Bước 4: Gán các tín hiệu NMR trên phổ cho các nguyên tử hay nhóm chức dựa trên các đặc trưng phổ.
- Bước 5: Sàng lọc, sắp xếp các nguyên tử, các nhóm chức một cách hợp lý thành cấu trúc không gian của phân tử.
- Bước 6: Kiểm tra lại công thức cấu trúc.
55
3.2.3.3 Cách xác định kiểu ức chế
Kiểu ức chế của hợp chất được xác định dựa theo phương pháp của Nguyen et al. (2006). Khoảng nồng độ xanthine thích hợp mà tại đó độ hấp thu tia UV (bước sóng 290 nm) tăng dần được xác định trước khi xác định kiểu ức chế. Thí nghiệm xác định khoảng nồng độ xanthine thích hợp được thực hiện trờn đĩa 96 giếng. Giếng thử ban đầu được cho vào 85 àL dung dịch đệm phosphate (0,05 M, pH 7,5) và 30 àL enzyme XO 0,02 U/mL. Sau khi ủ ở 25°C trong thời gian 15 phỳt, 60 àL xanthine (với cỏc nồng độ 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 và 200 àM) được cho vào giếng. Hỗn hợp tiếp tục được ủ ở 25°C trong 2 phỳt và sau đú dừng phản ứng bằng cỏch cho vào hỗn hợp 25 àL HCl 1 N. Cuối cùng, hỗn hợp được đo ở bước sóng 290 nm. Giếng trắng là giếng có chứa 115 àL dung dịch đệm phosphate. Mỗi giếng thử được lặp lại 3 lần.
Độ hấp thu tia UV (bước sóng 290 nm) của lượng acid uric tạo thành trong mỗi nghiệm thức được xác định là ∆A=Agiếng thử-Agiếng trắng. So sánh ∆A của các nồng độ xanthine khác nhau để xác định khoảng nồng độ xanthine thích hợp mà tại đó độ hấp thu tia UV tăng tuyến tính để làm cơ sở xây dựng đồ thị Linewearver-Burk. Đồ thị Linewearver-Burk là cơ sở để xác định kiểu ức chế.
Để xác định kiểu ức chế của hợp chất tác dụng lên enzyme, tiến hành đo độ hấp thu tia UV khi khảo sát 2 nồng độ hợp chất trên và dưới giá trị IC50. Ứng với mỗi nồng độ hợp chất, nồng độ cơ chất ([S]) sẽ thay đổi (các nồng độ đã được xác định ở thí nghiệm khảo sát nồng độ cơ chất). Cụ thể mỗi giếng thử được cho vào 35 àL dung dịch đệm phosphate, 50 àL dung dịch cao chiết và 30 àL dung dịch enzyme XO. Hỗn hợp được lắc và ủ ở 25°C trong 15 phút. Tiếp theo, hỗn hợp được thờm vào 60 àL xanthine (với cỏc nồng độ thay đổi khỏc nhau). Hỗn hợp tiếp tục được ủ ở 25°C trong 2 phỳt và cho thờm 25 àL dung dịch HCl 1 N để cố định mẫu. Sau đó, hỗn hợp được đo ở bước sóng 290 nm. Song song với giếng mỗi giếng thử, một giếng đối chứng cũng được thực hiện. Giếng đối chứng là giếng được thực hiện tương tự như giếng thử, nhưng thay dung dịch cao chiết bằng dung dịch đệm. Tương ứng với mỗi giếng thử hoặc giếng đối chứng có một giếng trắng thử hoặc giếng trắng đối chứng. Giếng trắng thử hoặc giếng trắng đối chứng là giếng được thực hiện tương tự như giếng thử hoặc giếng đối chứng nhưng HCl được cho vào giếng trước khi cho enzyme XO vào.
Ghi nhận số liệu, tính ∆A=∆Ađối chứng - ∆Athử (∆Ađối chứng =Ađối chứng – Atrắng đối
chứng;∆Athử =Athử –Atrắng thử), tính vận tốc của phảnứng (V0) bằng cách dựa vàođường chuẩn acid uric (vận tốc của phản ứng thể hiện qua lượng acid uric được hình thành trong mỗi phút), dựng đồ thị Lineweaver-Burk biểu diễn 1/V0 theo 1/[S] với các nồng độ của chất ức chế. Vị trí cắt nhau của các đường thẳng trên
56
đồ thị Lineweaver-Burk là cơ sở để xác định kiểu ức chế. Đối với kiểu ức chế cạnh tranh, vị trí cắt nằm trên trục tung. Kiểu ức chế không cạnh tranh, các đường thẳng sẽ cắt nhau trên trục hoành. Đối với kiểu ức chế hỗn hợp, vị trí cắt của các đường thẳng không nằm trên trục tung và trục hoành. Trường hợp đặc biệt khi các đường thẳng có độ nghiêng bằng nhau, song song với nhau không hội tụ tại một điểm thì được gọi là ức chế kháng cạnh tranh.