2.5 Các nghiên cứu xác định một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme
2.5.1 Các nghiên cứu thảo dược ức chế enzyme xanthine oxidase trên thế giới
Năm 2007, Umamaheswari et al. đã nghiên cứu khả năng ức chế hoạt động của enzyme XO từ 6 loài thảo dược được sử dụng để điều trị gout theo dân gian của người Ấn Độ. Dịch chiết methanol của Coccinia grandis (bình bát dây), Datura metel (cà độc dược), Strychnos nuxvomica (cây mã tiền) và Vitex negundo (cõy ngũ trảo) ở nồng độ 100 àg/mL ức chế hơn 50% enzyme XO.
Trong thử nghiệm trên chuột được gây bệnh bằng kali oxonate, dịch chiết methanol của Coccinia grandis và Vitex negundo làm giảm nồng độ acid uric trong máu lần lượt là 3,9 (mg/dL) và 6,26 (mg/dL), so với đối chứng về nồng độ acid uric trong máu chuột bệnh là 11,42 (mg/dL). Hiệu quả này là gần bằng với nồng độ acid uric trong máu của chuột bệnh được điều trị bằng AP (3,89 mg/dL).
Apaya và Chichioco-Hernandez (2011) đã nghiên cứu khả năng ức chế enzyme XO của 14 cây thuốc kháng viêm ở Philippin. Kết quả cho thấy, dịch chiết loài Mimosa pudica (cây trinh nữ) ức chế mạnh nhất với IC50 = 32,8 μg/mL (IC50 của chất đối chứng AP là 6,1 μg/mL). Mohammad et al. (2011) đã sàng lọc khả năng ức chế enzyme XO của 23 loài thảo dược thuộc 12 họ ở Jordan. Kết quả chứng minh được dịch chiết của 6 loài có khả năng ức chế XO. Trong đó, dịch chiết của Salvia spinosa (thuộc họ Hoa môi) có giá trị IC50 = 53,7 μg/mL so với đối chứng dương AP là IC50 = 4,6 μg/mL.
Nghiên cứu sử dụng nước cất, methanol 70%, ethanol tuyệt đối để tách chiết chất ức chế enzyme XO từ 20 bộ phận của 5 loài thảo dược ở Malaysia là Averrhoa carambola (cây khế), Manilkara zapota (sa bô chê), Dimocarpus longan malesianus (nhãn Mã Lai), Carica papaya (đu đủ) và Salacca zalacca (thuộc họ Cau). Kết quả cho thấy cao chiết nước của lá Carica papaya trưởng thành sau khi được tối ưu hóa có khả năng ức chế enzyme XO lên đến 86,93%
(IC50= 4,33 g/mL), so với AP là 93,69% (IC50=3,74 g/mL) (Azmi et al., 2012).
Stalin et al. (2013) đã công bố rằng cao chiết từ các bộ phận khác nhau của cây đu đủ cũng có tác dụng ức chế enzyme XO nhưng hiệu quả thấp hơn AP. Raju et al. (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng các phân đoạn của dịch chiết lá Erythrina stricta (thuộc chi Vông nem, họ Đậu) trên nồng độ acid uric trong máu và hoạt động của enzyme XO trong chuột tăng acid uric máu gây ra bởi kali oxonate. Các phân đoạn ether, chloroform và ethyl acetate có khả năng làm giảm nồng độ acid uric trong máu ở chuột tăng uric acid máu và ức chế đáng kể hoạt động của enzyme XO trong gan chuột nhưng yếu hơn AP. Kết quả cho thấy, lá của
18
Erythrina stricta có thể được sử dụng như là một nguồn thảo dược tiềm năng điều trị bệnh gout.
Theo Muthiah (2012), khả năng ức chế enzyme XO của dịch chiết từ lá, quả và vỏ quả của Citrus aurantium (cam chua), Citrus limetta (chanh ngọt Địa Trung Hải) và Citrus limon (cây chanh). Vỏ quả của C. limetta có tác dụng ức chế enzyme XO mạnh nhất (IC50 = 40,16 g/mL), nhưng yếu hơn AP (IC50 = 6,66 g/mL). Abdullahi et al. (2012) đã nghiên cứu khả năng ức chế enzyme XO của các phân đoạn của lá cây Crateva adansonii (mấm núi). Kết quả cho thấy phân đoạn chloroform có tác dụng mạnh nhất với IC50 = 20,20 g/mL, so với AP IC50
= 5,70 g/mL. Chatterjee et al. (2012) đã công bố tác dụng ức chế enzyme XO của hai dịch chiết ethanol và chloroform từ lá Polyalthia longifolia (cây hoàng nam), trong đó dịch chiết chloroform có khả năng ức chế mạnh hơn (IC50 = 42,8
g/mL) (đối chứng dương AP có IC50 = 29,2 g/mL). Cao chiết ethanol, cao chiết nước, các cao chiết phân đoạn (n-hexane, ethyl acetate và n-butanol) của 13 cây thuốc ở Indonesia đã được khảo sát khả năng ức chế enzyme XO. Trong đó, cao chiết phân đoạn ethyl acetate được chiết xuất từ cao tổng ethanol của cây Woodfordia floribunda thể hiện khả năng ức chế enzyme XO mạnh nhất
IC50=38,92 g/mL, so với AP IC50 = 2,49 g/mL (Agustin et al., 2013).
Khả năng ức chế enzyme XO của các phân đoạn dịch chiết (ethyl acetate, dichloromethane, n-butanol, n-hexane và nước) của cây Pandiaka angustifolia (thuộc họ Dền Amaranthaceae) đã được khảo sát. Ở nồng độ 100 g/mL, phân đoạn n-hexane thể hiện khả năng ức chế mạnh nhất (77,61%), so với AP là 77,13% (Thiombiano et al., 2014). Nghiên cứu của Rini et al. (2014) đã đánh giá khả năng ức chế enzyme XO của lá cây Sonchus arvensis (thuộc họ Cúc). IC50 của dịch chiết ethanol lá S. arvensis là 23,64 g/mL. Phân đoạn n-hexane, ethyl acetate và nước lần lượt là 263,19 μg/mL; 16,20 μg/mL và 141,80 μg/mL. Trong khi đó, lá cây này được chiết xuất với ethyl acetate có IC50 là 15,29 μg/mL, so với AP có IC50 là 4,84 μg/mL.
Khả năng ức chế enzyme XO của lá cây Lycium arabicum (thuộc họ Cà) đã được Trabsa et al. (2015) khảo sát. Bốn dịch chiết của lá cây Lycium arabicum gồm methanol, chloroform, ethyl acetate và nước đều cho thấy khả năng ức chế enzyme XO. Trong đó, dịch chiết ethyl acetate cho thấy khả năng ức chế mạnh nhất với IC50 là 0,017 mg/mL. Đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy dịch chiết ethyl acetate và chloroform ức chế theo kiểu cạnh tranh, 2 dịch chiết còn lại ức chế theo kiểu hỗn hợp. Nhóm tác giả của nghiên cứu này còn cho thấy rằng dịch chiết ethyl acetate có khả năng làm giảm acid uric trong máu chuột bị gây tăng acid uric (từ nồng độ 4,71 mg/L giảm xuống còn 1,78 mg/L).
19
Cao thô được chiết xuất từ nước và các cao phân đoạn (chloroform, ethyl acetate, butanol và nước) của lá cây nhũ hương Pistacia lentiscus đã được khảo sát khả năng ức chế XO. Kết quả cho thấy, cao thô và cao phân đoạn ethyl acetate có tác dụng ức chế hơn 50% enzyme XO ở nồng độ 100 mg/mL. Cụ thể là chất đối chứng AP ức chế 71,8% enzyme XO, phân đoạn ethyl acetate ức chế 60,2%
(IC50 = 2,50 mg/mL) và cao thô ức chế 55,3% (IC50 = 2,57 mg/mL). Từ kết quả trên, Haddi và Marouf đã đề xuất có thể sử dụng cao thô và cao phân đoạn ethyl acetate được chiết xuất từ cây Pistacia lentiscus thay thế cho AP (Haddi and Marouf, 2015).
Một số thảo dược trên thế giới có khả năng ức chế enzyme XO và tác giả nghiên cứu được tổng hợp trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1: Tổng hợp một số thảo dược trên thế giới có khả năng ức chế enzyme XO TT Tên khoa học
Coccinia grandis (bình bát dây), Datura metel 1 (cà độc dược), Strychnos nuxvomica (cây mã tiền) and Vitex negundo (cây ngũ trảo)
2 Mimosa pudica (cây trinh nữ)
3 Salvia spinosa (thuộc họ hoa môi)
4 Lá trưởng thành của cây Carica papaya (đu đủ)
5 Lá Erythrina stricta (thuộc chi Vông nem, họ Đậu)
6 Citrus limetta (chanh ngọt Địa Trung Hải)
7 Phân đoạn
Crateva adansonii (mấm núi)
8 Cao chiết chloroform từ lá Polyalthia longifolia
(cây hoàng nam)
9 Phân đoạn
floribunda
10 Pandiaka
Amaranthaceae)
11 Dịch chiết
arvensis (thuộc họ Cúc)
12 Dịch chiết
arabicum
113 Lá cây nhũ hương Pistacia lentiscus
Một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO đã được tiến hành phân lập chất và xác định được một số chất có khả năng ức chế enzyme XO, cụ thể như sau:
Acid caffeic (Hình 2.12) là một chất ức chế enzyme XO yếu được phân lập từ cao ethanol của lá cây dương xỉ Cyathea spinulosa. Đây là loại cây được dân gian dùng trong điều trị bệnh gout (Chiang et al., 1994). Năm 2015, Huo et al. đã tiến hành phân lập các hợp chất ức chế enzyme XO từ cao chiết nước của lá tía tô Perilla frutescens. Kết quả của nghiên cứu một lần nữa khẳng định khả năng ức chế enzyme XO của acid caffeic với IC50 của acid caffeic, vinyl caffeate và chất đối chứng AP lần lượt là 121,22 àM, 31,26 àM và 2,07 àM. Cả hai chất acid caffeic và vinyl caffeate đều ức chế XO theo kiểu cạnh tranh. Apigenin được phõn lập từ lỏ tớa tụ cho thấy khả năng ức chế XO với IC50 là 0,44 àM. Apigenin ức chế XO theo kiểu hỗn hợp (Huo et al., 2015).
Hình 2.12: Cấu trúc phân tử acid caffeic (A), vinyl caffeate (B) và apigenin (C) (Huo et al., 2015)
Các flavonoid quan trọng như kaempferol, myricetin, quercetine và genistein thể hiện sự ức chế enzyme XO tốt (Selloum et al., 2001). Kaempferol và quercetine (Hình 2.13) được phân lập từ cao chiết nước của lá đu đủ Carica papaya cũng cho thấy khả năng ức chế enzyme XO rất tốt (Azmi et al., 2012).
Hình 2.13: Cấu trúc phân tử của quercetine (A) và kaempferol (B) (Jang et al., 2011; Furia et al., 2014)
21
Các nhóm flavonoid khác nhau có khả năng ức chế XO khác nhau. Các flavonoid không có cấu trúc phẳng ức chế yếu hoặc không thể hiện hoạt tính ức chế XO. Nagao et al. (1999) đã nghiên cứu mối liên hệ giữa hoạt tính ức chế XO và cấu trúc phân tử của flavonoid.
Khả năng ức chế XO của các nhóm flavonoid khác nhau được thể hiện ở Bảng 2.2
Bảng 2.2: Sự ức chế XO bởi các loại flavonoid (Nagao et al., 1999)
Nhóm Hợp chất
Flavone Chrysin
Luteolin Flavone
Nhóm thế IC50 (μM)
5,7-OH 5,02
5,7,3’,4’-OH 0,96 Không ức chế
Flavonol
Kaempferol
Quercetin Myricetin Rhamnetin Isorhamnetin
Tangeretin Rutin Isoflavone Genistein
Daidzein
Flavanone
Hesperetin
Flavanonol
Flavanol Taxifolin
(+)-Catechin (-)-Epicatechin (-)-Epigallocatechin
(-)-Epicatechin gallate (-)-Epigallocatechin Dihydrochalcone gallate
Phloretin Anthocyanidin Apigenidin
Pelargonidin Cyanidin Peonidin Delphinidin
3,5,7,4’-OH 3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,3’,4’,5’-OH 3,5,3’,4’-OH;7-OMe
3,5,7,3’-OH;4’-OMe 3,5-OH;6,7,8-OMe
5,7,3’,4’- OH;3Orutinosyl
5,7,4’-OH 7,4’-OH 5,7,3’-OH;4’-OMe
3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,3’,4’,5’-OH 3,5,7,3’,4’-OH; 3-O-
galloyl 3,5,7,3’,4’-OH; 3-O-
galloyl
* 5,7,4’-OH 3,5,7,4’-OH 3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,4’-OH;3’-OMe
3,5,7,3’,4’5’-OH
0,67 0,44 1,27
>50 0,40
>100 46,8 83,0
>100 27,4
>100 Không ức chế Không ức chế
>100
48,5
44,7 0,66 29,1 21,9 27,8 26,0 52,4
Trong nhóm flavone, chỉ có chrysin và luteolin có nhóm hydroxyl ở vị trí C-5 và C-7 của khung flavone ức chế XO khá mạnh. Quercetin có hoạt tính ức chế tương tự luteolin. Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng nhóm hydroxyl ở vị
22
trí C-5 và C-7 đóng vai trò quan trọng trong ức chế XO. Vị trí C-7 trên cấu trúc phân tử của nhóm flavone và flavonol có ảnh hưởng đến sự ức chế XO. Tuy nhiên, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cấu trúc vòng B của nhóm catechol mặc dù có khả năng oxy hoá cao nhưng lại không ức chế XO. Nhóm isoflavone với một số chất như genistein và daidzein mặc dù có nhóm hydroxyl ở vị trí C-7 nhưng lại ức chế XO yếu hơn. Điều này chứng tỏ cấu trúc flavone và flavonol phẳng với nhóm 7 – hydroxyl có thể ức chế XO mạnh. Các hợp chất chrysin, luteolin, kaempferol, quercetin, myricetin và isorhamnetin ức chế enzyme XO theo kiểu hỗn hợp (Nagao et al., 1999).
Đã có báo báo chứng minh rằng tinh dầu từ lá cây quế Cinnamomum osmophloeum cú hoạt tớnh ức chế enzyme XO mạnh (IC50 = 16,3 àg/mL).
Cinnamaldehyde (Hình 2.14) là hợp chất chính của tinh dầu thể hiện hoạt tính ức chế enzyme XO tiềm năng với IC50 = 8,4 àg/mL (IC50 của AP là 0,6 àg/mL).
Ngoài ra, cinnamaldehyde còn cho thấy hiệu quả làm giảm acid uric máu trên chuột thực nghiệm. Dựa trên các kết quả trong nghiên cứu này, cinnamaldehyde được đề xuất phát triển thành thuốc hạ uric acid máu (Wang et al., 2008).
Hình 2.14: Cấu trúc phân tử của cinnamaldehyde (Erasmus, 2013) Hydroxychavicol (Hình 2.15) được phân lập từ dịch chiết chloroform của lá trầu Piper betle có tác dụng ức chế enzyme XO mạnh hơn cả AP (Kazuya et al., 2009). Hai chất mới tương tự hydroxychavicol được phân lập từ cao methanol phần trên mặt đất của cây trầu Piper nudibaccatum. Hai chất này được Liu et al. (2015) đặt tên là nudibaccatumin A và B (Hình 2.16). Nghiên cứu cũng đã cho thấy nudibaccatumin A và B có khả năng ức chế enzyme XO (với IC50 lần lượt là 62,94 và 70,67 μM). Nghiên cứu này còn cho thấy phần trên mặt đất của Piper nudibaccatum có chứa hợp chất neotaiwanensol B có khả năng ức chế enzyme XO mạnh hơn hydroxychavicol và AP (với IC50 của neotaiwanensol B, hydroxychavicol và của AP lần lượt là 0,28; 0,38 và 7,06 μM).
23
Hình 2.15: Cấu trúc phân tử của hydroxychavicol (Singburaudom, 2015)
Hình 2.16: Cấu trúc phân tử của nudibaccatumin A (1), nudibaccatumin B (2) và neotaiwanensol B (3) (Liu et al., 2015)
Hạt Semecarpus anacardium L. (đào lộn hột) đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở Ấn Độ cho việc điều trị bệnh gout. Các phân đoạn của S.
Anacardium được đánh giá là có khả năng ức chế enzyme XO và các hoạt động kháng oxy hóa. Phân đoạn ethyl acetate cho thấy khả năng ức chế enzyme XO mạnh nhất, từ phân đoạn này phân lập được một hợp chất biflavonoid là
tetrahydroxymentoflavone (Hình 2.17). Giá trị IC50 của tetrahydroxymentoflavone và AP để ức chế 50% enzyme XO lần lượt là 92 nM và 100 nM. Tetrahydroxymentoflavone phân lập được là một chất ức chế enzyme XO mạnh. Kết quả nghiên cứu đã ủng hộ việc sử dụng hạt S. Anacardium điều trị bệnh gout theo y học dân gian (Arimboor et al., 2014).
Hình 2.17: Cấu trúc phân tử của tetrahydroxymentoflavone (Arimboor et al., 2014)
24
Mười flavonoid (Hình 2.18) được phân lập từ cao methanol của hoa Chrysanthemum sinense (một loại cúc) có khả năng ức chế enzyme XO mạnh hơn cả AP với IC50 từ 0,13-1,33 àM (IC50 của AP là 2,5 àM) (Bảng 2.3). Cũng từ hoa của Chrysanthemum sinense đã phân lập được một flavone glycoside mới là acacetin-7-O-(3-O-acetyl-β-D-glucopyranoside) cũng có hoạt tính ức chế enzyme XO. Tuy nhiên, khả năng ức chế enzyme XO của chất này yếu hơn AP.
Những hợp chất trên đều ức chế theo kiểu cạnh tranh (Nguyen et al., 2006).
Hình 2.18: Cấu trúc phân tử của các flavonoid được phân lập từ hoa của Chrysanthemum sinense (Nguyen et al., 2006)
Bảng 2.3: Khả năng ức chế enzyme XO của các flavonoid được phân lập từ hoa của Chrysanthemum sinense (Nguyen et al., 2006)
TT Hợp chất
1 Acacetin-7-O-(3-O-acetyl-β-D-
glucopyranoside)
2 Selgin
3 Luteolin
4 Diosmetin
5 Apigenin
6 Eupafolin
7 Chrysoeriol
8 Acacetin
9 Jaceidin
10 Tricetin 3’,4’,5’-trimethyl ether
11 5,7,3’-trihydroxy-6,4’,5’-trimethoxyflavone AP
Xu et al. (2014) đã nghiên cứu khả năng ức chế enzyme XO của 7 hợp chất được chiết xuất từ cao ethanol (60%) của thân cây Homonoia riparia (cây rì rì).
Kết quả cho thấy 6 hợp chất ức chế enzyme XO yếu và một hợp chất là riparsaponin (Hình 2.19) có khả năng ức chế mạnh (IC50 = 11,16 nmol/mL), gần tương đương với đối chứng dương là AP (IC50 = 11,84 nmol/mL).
Hình 2.19: Cấu trúc phân tử của riparsaponin (Xu et al., 2014) Ngoài caffeic acid, vinyl caffeate và apigenin, hai chất khác có khả năng ức chế XO cũng được phân lập từ lá tía tô Perilla frutescens đó là acid rosmarinic và methyl rosmarinate (Hình 2.20). Hai chất này ức chế enzyme XO theo kiểu cạnh tranh với giỏ trị IC50 lần lượt là 91,72 và 26,59 àM (IC50 của AP là 2,07 àM (Huo et al., 2015).
Hình 2.20: Cấu trúc phân tử của acid rosmarinic (A) và methyl rosmarinate (B) (Huo et al., 2015)
26
Một số thảo dược đã được phân lập chất và xác định các chất ức chế XO được tổng hợp trong Bảng 2.4.
Bảng 2.4: Các hợp chất ức chế enzyme XO phân lập được từ thảo dược
TT Tên
dược
1 Cây
Cyathea spinulosa
Acid caffeic 2
3 Lácây quế
Cinnamomu m
osmophloeum
4 Lá trầu Piper betle Piper nudibaccatu m
5 Lá đu đủ Carica papaya
6 Hạt Semecarpu s
anacardiu m
flavonoid
Cinnamaldehyde
Hydroxychavicol
Các flavonoid Azmi et al., (kaempferol, 2012
quercetine,…)
Quercetine
Kaempferol
Tetrahydroxymen Arimboor et
toflavone al., 2011
27
trimethoxyflavon e
8 Thân cây rì rì Riparsaponin Homonoia riparia
9 Lá tía tô Acid caffeic Perilla
frutescens Acid caffeic
Vinyl caffeate
Acid rosmarinic
Methyl rosmarinate
Apigenin
Nguyen et al., 2006
Xu et al., 2014
Huo et al., 2015
28