2.7.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (rắn – lỏng)
Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến ngập bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên.
Sau đó, dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Ngoài kỹ thuật chiết ngâm dầm, kỹ thuật chiết ngấm kiệt và kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet cũng thuộc kỹ thuật chiết rắn–lỏng. Tuy nhiên 2 kỹ thuật này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
2.8 Các phương pháp phổ nghiệm xác định công thức phân tử các hợp chất
2.8.1 Phổ hồng ngoại (IR)
Bức xạ hồng ngoại là vùng bức xạ nằm giữa vùng ánh sáng thấy được và vi sóng. Bức xạ hồng ngoại có tần số trong khoảng 430 THz – 300 GHz thường được hấp thụ bởi phân tử các hợp chất hữu cơ và chuyển thành năng lượng dao động phân tử. Sự hấp thụ này được lượng tử hóa tạo thành một dãy phổ dao động phân tử. Trong nghiên cứu cấu trúc các hợp chất hữu cơ thường chỉ sử dụng vùng phổ có số sóng từ 4000 đến 400 cm-1. Tần số hay bước sóng hấp thụ phụ thuộc vào khối lượng của các nguyên tử, các liên kết và cấu trúc của phân tử.
Vị trí các mũi hấp thụ trong phổ hồng ngoại thường được biểu diễn dưới dạng số sóng với đơn vị được sử dụng hiện nay là cm-1. Bước sóng (λ) trước đây thường sử dụng đơn vị là micromet. Số sóng là nghịch đảo của bước sóng: cm-1 = 100.000/àm.
Cường độ của các mũi hấp thụ có thể được biểu diễn bằng hệ số truyền qua (trasmittance, T) hoặc hấp thụ (absorbance, A). Sự liên hệ giữa hai đơn vị này thể
38
hiện qua biểu thức: A = log10(1/T). Cường độ các mũi hấp thụ thường được miêu tả là mạnh, trung bình, yếu (Nguyễn Hữu Đỉnh và Trần Thị Đà, 2019).
2.8.2 Phổ tử ngoại – Khả kiến (UV-VIS)
Hầu hết các hợp chất hữu cơ không hấp thụ vùng bức xạ điện từ thuộc tử ngoại và khả kiến, viết tắt là UV-VIS (Ultraviolet-Visible), ứng với bước sóng từ 190–800 nm. Do vậy, phổ hấp thụ trong vùng này chỉ được ứng dụng giới hạn cho một số nhóm hợp chất hữu cơ. Phổ tử ngoại và khả kiến của các hợp chất hữu cơ gắn liền với bước chuyển electron giữa các mức năng lượng electron trong phân tử khi các điện tử chuyển từ các obitan liên kết hoặc không liên kết lên các obitan phản liên kết có mức năng lượng cao hơn, đòi hỏi phải hấp thụ năng lượng từ bên ngoài. Do vậy, phổ tử ngoại và khả kiến liên quan chặt chẽ đến cấu tạo, nối đôi liên hợp và vòng thơm (Nguyễn Hữu Đỉnh và Trần Thị Đà, 2019).
2.8.3 Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối lượng hay còn gọi là khối phổ (Mass Spectroscopy, MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử chất đó. Hợp chất cần nghiên cứu đầu tiên được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó được ion hóa bằng các phương pháp thích hợp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà người ta phân biệt máy khối phổ ion dương hoặc ion âm. Loại máy khối phổ làm việc với ion dương cho nhiều thông tin hơn nên được dùng phổ biến hơn. Đối với các hợp chất hữu cơ, khối phổ thường được dùng trong quá trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc. Các phương pháp phổ hồng ngoại và phổ tử ngoại, phân tử chất nghiên cứu được giữ nguyên sau khi phân tích, còn phương pháp phổ khối lượng, các phân tử chất nghiên cứu bị
“phá hủy” để phân tích. Do vậy, máy khối phổ được chế tạo để thực hiện 3 nhiệm vụ cơ bản là: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí (làm bay hơi mẫu nghiên cứu ởáp suất thấp và ở nhiệt độ thích hợp); ion hóa các phân tử khí đó; phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỉ số khối lượng/điện tích (m/ze) của chúng. Vì xác suất tạo thành các ion có điện tích bé hơn 1 là rất thấp và vì điện tích electron e là một hằng số, do đó thông thường m/ze chính là khối lượng của ion. Như thế máy khối phổ là một thiết bị tạo ra các ion và xác định khối lượng của chúng (Nguyễn Hữu Đỉnh và Trần Thị Đà, 2019).
2.8.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Theo thuyết cấu tạo nguyên tử, nguyên tử gồm có hạt nhân và lớp vỏ điện tử. Giả thiết rằng hạt nhân có dạng hình cầu có điện tích dương và mật độ điện tích phân bố đồng đều trên mặt cầu. Một số loại hạt nhân hoạt động bằng cách tự
39
quay quanh trục của nó và vì hạt nhân mang điện tích dương nên chúng sẽ giống như những thanh nam châm nhỏ, vì vậy chúng sẽ tương tác với từ trường bên ngoài. Không phải tất cả các hạt nhân mà chỉ các hạt nhân có số spin lẻ (1H, 13C, ...) mới có đặc trưng này. Nếu không có sự tác động của từ trường bên ngoài thì các spin hạt nhân của những hạt nhân có từ tính sẽ định hướng theo vô số phương. Khi mẫu chất khảo sát có chứa những hạt nhân này được đặt vào giữa hai cực của một nam châm mạnh (từ trường B0), các hạt nhân sẽ bị định hướng theo hướng của nam châm: song song cùng chiều hoặc song song ngược chiều với từ trường của nam châm.
Hai định hướng này mức năng lượng khác nhau: định hướng song song cùng chiều có mức năng lượng thấp hơn định hướng song song ngược chiều.
Nếu hạt nhân này (đã có định hướng) được chiếu bởi một bức xạ điện từ có tần số thích hợp, sự hấp thu năng lượng sẽ xảy ra và lúc đó spin trạng thái năng lượng thấp sẽ nhảy chuyển lên spin trạng thái năng lượng cao hơn. Khi có hiện tượng nhảy chuyển spin như thế, người ta nói là hạt nhân đã cộng hưởng với bức xạ chiếu vào, gọi là cộng hưởng từ hạt nhân. Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thụ (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của phân tử chất đó. Có hai cách xác định năng lượng cộng hưởng này. Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét. Cách thứ hai là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier Transform - NMR, FT-NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay. Khả năng đáp ứng với sự cộng hưởng từ hạt nhân của hai loại hạt nhân 1H (proton) và 13C không giống nhau. Tất cả các hạt nhân có số proton lẻ (1H, 19F, 31P,…) cũng như các hạt nhân có số nơtron lẻ (13C) đều có từ tính nên sẽ có hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân. Các hạt nhân có số proton và nơtron chẵn (12C, 16O) sẽ không có hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân (Nguyễn Hữu Đỉnh và Trần Thị Đà, 2019).
40