CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ
3.2.4.1 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột bình thường
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thùy Dương và ctv. (2011a). Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng đực, khỏe mạnh, có trọng lượng trung bình 28,3±2,17 g. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm và chia ngẫu nhiên thành 6 nghiệm thức (NT), mỗi NT 7 con chuột:
+ NT1 (Nhóm đối chứng sinh lý): chuột bình thường uống nước.
+ NT2: Nhóm uống dung môi pha thuốc là natri carboxymetyl cellulose
(CMC-Na) 0,5%.
+ NT3 (Nhóm đối chứng thuốc): uống AP được pha trong CMC-Na 0,5%
với liều 10 mg/kg.
+ NT 4, 5, 6 (Các nhóm thử): uống cao ethanol cỏ xước được pha trong CMC-Na 0,5% với các mức liều thử 150, 300 và 450 mg/kg.
Chuột được uống nước cất hoặc CMC-Na 0,5% hoặc AP hoặc cao chiết với cùng thể tích 0,1 mL/10 g chuột vào lúc 9 giờ hàng ngày trong vòng 5 ngày.
Trước khi dùng dung môi hoặc thuốc hoặc cao chiết 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường. Ngày thứ năm, sau khi uống thuốc lần cuối 2 giờ, giải phẫu lấy máu từ tim chuột. Máu chuột được cho vào ống chống đông và mang đến Trung tâm Bảo vệ Sức khỏe Lao động và Môi trường Thành phố Cần Thơ để đo nồng độ acid uric. Đề tài thực hiện lấy máu từ tim chuột bởi vì chỉ có lấy máu từ tim chuột mới đủ lượng máu để đo acid uric (lượng máu cần thiết để đo acid uric ít nhất là 0,5 mL).
Nguyên lí định lượng acid uric trong máu: Acid uric chuyển thành allantoin và peroxide dưới tác dụng của uricase. Peroxide phản ứng với 3,5-dichloro-2- hydrobenzenesulfonic acid và 4-aminophenazone với sự có mặt của peroxidase tạo phức chất quinoneimine có màu tím đỏ. Phức chất quinoneimine được định lượng bằng cách đo ở bước sóng 546nm. Từ đó suy ra được lượng acid uric trong máu.
57
- Thông số đánh giá:
+ Nồng độ acid uric trong máu chuột thí nghiệm.
+ Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric trong máu chuột ở NT2, NT3, NT4, NT5 và NT6 so với NT1.
I(%) = C1 Ct
× 100%
C1 Trong đó:
I (%): Tỷ lệ giảm acid uric trong máu chuột ở NT2, NT3, NT4, NT5 và NT6 so với NT1.
C1: Nồng độ acid uric trong máu chuột ở NT1.
Ct: Nồng độ acid uric trong máu chuột ở NT2, NT3, NT4, NT5 và NT6.
3.2.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thùy Dương và ctv. (2011a). Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng đực, khỏe mạnh, có trọng lượng trung bình 28,3±2,17 g. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm và chia ngẫu nhiên thành 7 NT, mỗi NT 7 con chuột:
+ NT1 (Nhóm đối chứng sinh lý): chuột bình thường uống nước.
+ NT2: Nhóm uống dung môi pha thuốc CMC-Na 0,5%.
+ NT3 (Nhóm đối chứng bệnh lý): chuột uống CMC-Na 0,5%, gây tăng cấp acid uric bằng cách tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonate.
+ NT4 (Nhóm đối chứng thuốc) chuột uống thuốc đối chiếu AP được pha trong CMC-Na 0,5% liều 10 mg/kg, gây tăng cấp acid uric bằng cách tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonate.
+ NT5, 6, 7 (Các nhóm thử): chuột uống cao ethanol cỏ xước được pha trong CMC-Na 0,5% với các mức liều 150, 300, 450 mg/kg, gây tăng cấp acid uric bằng cách tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonate.
Chuột được uống nước cất hoặc CMC-Na 0,5% hoặc AP hoặc cao chiết với cùng với thể tích 0,1 mL/10 g trọng lượng chuột vào lúc 9 giờ hàng ngày trong vòng 5 ngày trước khi làm thực nghiệm. Trước khi dùng nước cất hoặc thuốc hoặc cao chiết 1,5 giờ, chuột nhịn ăn nhưng được uống nước bình thường. Ngày thứ năm, chuột ở các NT được tiêm màng bụng kali oxonate (pha trong CMC-Na 0,5%) với liều 500 mg/kg (ở NT1 và NT2, chuột được tiêm CMC-Na 0,5%) một giờ trước khi uống thuốc lần cuối. Sau khi uống thuốc 2 giờ, chuột được giải
58
phẫu để lấy máu từ tim chuột. Máu chuột được cho vào ống chống đông và chuyển đến Trung tâm Bảo vệ Sức khỏe Lao động và Môi trường Thành phố Cần Thơ để đo nồng độ acid uric.
Quy trình thí nghiệm được mô tả ở Hình 3.8.
4 ngày
Nhịn ăn Uống cao chiết,
Uống thuốc hàng ngày
Hình 3.9: Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate.
- Thông số đánh giá:
+ Nồng độ acid uric trong máu chuột thí nghiệm.
+ Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric trong máu chuột ở NT4, NT5, NT6 và NT7 so với NT3:
I% = C3 - Ct x 100%
C3 Trong đó:
C3: nồng độ acid uric trong máu chuột ở NT3.
Ct: nồng độ acid uric trong máu chuột ở NT4, NT5, NT6 và NT7.
I (%): tỷ lệ giảm acid uric trong máu chuột ở NT4, NT5, NT6 và NT7 so với NT3.
3.2.4.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao ethanol cỏ xước đến hoạt tính enzyme xanthine oxidase gan chuột thí nghiệm
Mục đích của thí nghiệm nhằm xác định phần trăm enzyme XO trong gan chuột bị ức chế khi chuột uống cao chiết ethanol cỏ xước với các nồng độ 150;
300 và 450 mg/kg. Từ kết quả đó góp phần giải thích kết quả thí nghiệm “Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric trong máu chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate”.
59
Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao ethanol cỏ xước đến hoạt tính enzyme XO gan chuột thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thùy Dương và ctv. (2011b). Gan chuột lấy từ thí nghiệm ở mục 3.2.4.2 được sử dụng để khảo sát hoạt tính enzyme XO.
Một gram gan của mỗi con chuột được cắt thành các mảnh nhỏ, cho vào ống nghiệm có sẵn 1 mL dung dịch đệm phosphate lạnh (pH = 7,5). Nghiền gan trong điều kiện lạnh đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm dần 14 mL dung dịch đệm phosphate lạnh vào dịch đồng thể và khuấy đều. Dịch nghiền thu được được ly tâm lạnh ở 4°C với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch nổi tiếp tục đem ly tâm lạnh ở 4°C với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 60 phút. Sau khi ly tâm, phần dịch trong được dùng để thực hiện phản ứng xác định hoạt tính enzyme.
Phản ứng enzyme được thực hiện trong ống nghiệm mẫu thử chứa 2,9 mL đệm phosphate (0,05M, pH 7,5), 2,5 mL dung dịch đệm cơ chất gồm xanthine 0,12 mM, EDTA 0,192 mM, kali oxonate 2,2 mM. Trước khi tiến hành phản ứng, dịch enzyme và cơ chất được ủ ở 37°C trong 15 phút. Thời gian phản ứng được tính từ lúc thêm 0,1 mL dịch enzyme vào ống nghiệm chứa dung dịch cơ chất. Tiếp tục ủ trong 30 phút. Sau đó, 0,5 mL HCl 1 N được thêm vào hỗn hợp để dừng phản ứng. Dung dịch sau phản ứng được đo ở bước sóng 290 nm.
Cuvette thạch anh được sử dụng có độ dày 1 cm.
Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự như mẫu thử, nhưng 0,5 mL HCl 1 N được đưa vào ống nghiệm trước khi cho dịch enzyme vào để bất hoạt enzyme.
Mẫu trắng là mẫu chứa 5,5 mL đệm phosphate (pH 7,5) và 0,5 mL HCl 1 N.
Mỗi đơn vị hoạt tính (U) của enzyme XO được định nghĩa là lượng enzyme xỳc tỏc chuyển 1 àmol xanthine thành acid uric trong mỗi phỳt ở điều kiện 37°C và pH 7,5. Hoạt tính riêng của enzyme (U/g protein) được xác định là số đơn vị hoạt tính của enzyme có trong 1 g protein. Hàm lượng protein trong gan được định lượng bằng phương pháp Lowry .
Thông số đánh giá của enzyme XO được trích từ gan chuột + Số đơn vị hoạt tính có trong 1 g gan
= (Athử- Achứng) × V
× 15 12,2 × Ve × T
+ Hoạt tínhriêng (U/g protein) = Số đơn vị hoạt tính có trong 1 g gan Số g protein có trong 1 g gan
60
Trong đó:
Athử : độ hấp thu quang phổ của mẫu thử.
Achứng: độ hấp thu quang phổ của của mẫu đối chứng.
12,2: hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sóng 290 nm (mM-1.cm-1).
V: thể tích phản ứng (mL).
15: hệ số pha loãng.
Ve: thể tích enzyme cho vào phản ứng (mL).
T: thời gian phản ứng (phút).
+ Mức độ ức chế enzyme được tính theo công thức: (1-B/A) x 100 (%) Trong đó, A và B là hoạt tính enzyme XO trên gan chuột nhóm đối chứng sinh lý và nhóm thử.