4.3 Phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase từ cao
4.3.1 Kết quả phân lập các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme
Cỏ xước sau khi thu hái (33 kg), sấy khô thu được 2,8 kg. Tiến hành chiết với ethanol, cô quay đuổi dung môi thu được 242 g cao tổng. Bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng, từ 242 g cao tổng đã thu được 21,5 g cao n-hexane, 49,6 g cao ethyl acetate, 76,7 g cao n-butanol và 61,4 g cao nước. Khả năng ức chế enzyme XO của các phân đoạn cỏ xước được trình bày trong Bảng 4.7.
Bảng 4.7: Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết cỏ xước, cao tổng và của AP Phân đoạn
n-Hexane Ethyl acetate n-Butanol Nước Cao tổng AP
Ghi chú: “-” không ức chế
74
Kết quả cho thấy, cao n-hexane và cao nước không có tác dụng ức chế enzyme XO. Cao ethyl acetate và phân đoạn n-butanol đều có tác dụng ức chế enzyme XO yếu hơn cao tổng (với IC50 lần lượt là 112 và 26,9 àg/mL). Nguyờn nhân của vấn đề này có lẽ do tác dụng ức chế enzyme XO cộng gộp của các phân đoạn ở cao tổng. So với AP (IC50 = 9,24 àg/mL) thỡ phõn đoạn ethyl acetate cú tác dụng ức chế enzyme XO yếu hơn. Tuy nhiên, phân đoạn ethyl acetate có tác dụng ức chế enzyme XO khá mạnh và mạnh nhất trong các phân đoạn. Vì vậy, phân đoạn ethyl acetate được chọn để tiếp tục tinh sạch chất có hoạt tính ức chế enzyme XO.
Quy trình phân lập các hợp chất được tóm tắt theo sơ đồ Hình 4.9.
àg/mL
Hình 4.10: Sơ đồ tóm tắt quá trình phân lập chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ cao ethanol cỏ xước
75
Các hợp chất đã phân lập được ký hiệu lần lượt là CXQ01, CXQ02, CXQ03, CXQ04 và CXQ05. Trong 5 hợp chất phân lập được, hợp chất CXQ01 và hợp chất CXQ04 không có hoạt tính ức chế enzyme XO nên không xác định cấu trúc của 2 chất này; 3 hợp chất còn lại là CXQ02, CXQ03 và CXQ05 có hoạt tớnh ức chế enzyme XO với IC50 lần lượt là 14,6; 103,2 và 37,7 àg/mL (Bảng 4.8). Tiến hành phổ nghiệm cấu trúc và đối chiếu với tài liệu tham khảo để xác định cấu trúc của các chất CXQ02, CXQ03 và CXQ05.
Bảng 4.8 Giá trị IC50 của các hợp chất Hợp chất IC50 (àg/mL)
CXQ01 -
CXQ02 14,6
CXQ03 103,2
CXQ04 -
CXQ05 37,7
Ghi chú: “-” không ức chế
4.3.1.1 Cấu trúc hợp chất CXQ02
Hợp chất CXQ02 thu được có dạng bột màu vàng, tan hoàn toàn trong acetone, methanol, nhiệt độ nóng chảy 308-314°C. Sắc ký của hợp chất hấp thụ đèn UV bước sóng 254 và 366 nm, hiện vết màu cam với thuốc thử vanillin/H2SO4 20% và hiện vết màu xanh đen với thuốc thử Fe3+.
Phổ 1H-NMR (Acetone-d6, 500 MHz) của hợp chất cho thấy có sáu tín hiệu proton, gồm năm tín hiệu proton nhóm olefin tại δH6,26 (1H, d, 1,5 Hz), 6,52 (1H, s), 7,00 (1H, d, 8,5 Hz), 7,69 (1H, dd, 8,0; 1,5 Hz), 7,82 (1H, d, 1,5 Hz) và một tín hiệu prton nhóm hydroxyl tại δH 12,16 (1H, brs). Trong đó, tín hiệu proton tại δH 7,69 ppm ghép cặp vị trí ortho với proton tại δH 7,00 ppm với cường độ tích phân là 8,5 và ghép cặp vị trí para với proton tại δH 7,82 ppm với cường độ tích phân là 1,5. Cùng với các đặc tính hoá lý của hợp chất có thể xác định hợp chất này là một flavonol với vòng C mang 2 nhóm thế.
Phổ 13C-NMR (Acetone-d6, 125 MHz) kết hợp với phổ DEPT cho thấy hợp chất CXQ02 có 15 carbon, gồm:
Một tín hiệu carbon nhóm ketone tại δC 176,5 ppm.
Mười bốn tín hiệu carbon nhóm olefin, trong đó năm tín hiệu là carbon bậc ba tại δC 94,5; 99,2; 115,8; 116,2 và 121,5 ppm, hai tín hiệu carbon bậc bốn tại δC 104,1 cùng 123,7 ppm và bảy tín hiệu carbon liên kết với nguyên tố có độ âm
76
điện cao như oxygen tại δC 136,7; 145,9; 148,3; 147,0; 147,8; 162,3 và 165,1 ppm. Đây là các tín hiệu đặc trưng của một flavonol.
Từ các dữ liệu phổ 1D-NMR có thể xác định hợp chất CXQ02 là một flavonol với năm nhóm thế hydroxyl trên khung cấu trúc và dự đoán hợp chất CXQ02 chính là quercetin (Hình 4.10). Tiến hành đối chiếu dữ liệu phổ của hợp chất CXQ02 và quercetin tại Bảng 4.9.
Hình 4.11: Hợp chất CXQ02 (quercetin)
Bảng 4.9: So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CXQ02 với phổ
1H-NMR và 13C-NMR của quercetin (Fathiazad et al., 2005)
Vị trí
CXQ02
2 3 4 5 6 7 8 9 10
1' 2' 3' 4' 5' 6'
*Đo trong Aceton-d6, 1H-NMR 500 MHz, 13C-NMR 125 MHz.
77
Nhận thấy sự tương đồng về độ dịch chuyển ở hầu hết các vị trí của hợp chất CXQ02 và quercetin nên có thể nhận danh CXQ02 chính là quercetin hay 2- (3,4-Dihydroxy-phenyl)-3,5,7-trihydroxy-chromen-4-one.
4.3.1.2 Cấu trúc hợp chất CXQ03
Hợp chất CXQ03 thu được dạng bột màu vàng nhạt, tan hoàn toàn trong dung môi chloroform, acetone và methanol, nhiệt độ nóng chảy 225-230°C. Vết sắc ký của hợp chất hấp thụ đèn UV bước sóng 254 và 366 nm, hiện vết màu vàng cam với thuốc thử vanillin/H2SO4 20% và hiện vết màu xanh đen với thuốc thử Fe3+. Các đặc trưng này giúp xác định CXQ03 chính là một flavonoid điển hình.
Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) cho thấy hợp chất CXQ03 có năm tín hiệu proton nhóm olefin tại δH 5,89 (1H, d), 5,91 (1H, d), 6,90 (1H, m), 6,93 (1H, m) và 6,96 (1H, m), một tín hiệu proton nhóm oxymethine tại δH 5,31 (1H, dd), hai tín hiệu proton nhóm methylene tại δH 2,70 (1H, dd) và 3,06 (1H, dd). Đây là các tín hiệu đặc trưng cho một flavanone.
Ngoài ra, còn có một tín hiệu proton nhóm methyl tại δH 3,86 (3H, s) cho thấy có xuất hiện một nhóm thế methoxy trên khung cấu trúc.
Phổ 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất CXQ03 có 16 carbon, gồm có:
Một tín hiệu carbon nhóm ketone tại δC 197,6 ppm.
Một tín hiệu carbon nhóm methylene tại δC 44,1 ppm.
Một tín hiệu carbon nhóm oxymethine tại 80,3 ppm.
Mười hai tín hiệu carbon nhóm olefin tại δC 168,4; 165,5; 164,8; 149,4;
147,8; 133,2; 119,0; 114,6; 112,6; 103,4; 97,1 và 96,2 ppm. Trong đó, có năm tín hiệu carbon bậc ba tại δC 119,0; 114,6; 112,6; 97,1 và 96,2 ppm cùng bảy tín hiệu carbon bậc bốn tại δC 168,4; 165,5; 164,8; 149,4; 147,8; 133,2 và 103,4 ppm.
Một tín hiệu carbon nhóm oxymethyl tại 56,5 ppm.
Từ các dữ liệu vừa phân tích có thể thấy đây chính là các tín hiệu đặc trưng của một flavanone với bốn nhóm thế hydroxyl và một nhóm oxymethyl trên khung cấu trúc.
Phổ HMBC giúp xác định vị trí của các tín hiệu trên khung cấu trúc với các tương quan gồm:
Proton tại δH 5,31 (H-2) tương quan với các carbon tại δC 114,6 (C-2'), 119,0 (C-6'), 133,2 (C-1'), 197,6 (C-4) và hai proton tại δH 2,70 (H-3α) cùng 3,06 (H-3β) tương quan với các carbon tại δC 80,3 (C-2), 103,4 (C-10), 133,2 (C-1') và
78
197,6 (C-4). Các tương quan này làm rõ vị trí của nhóm oxymethine và methylene trên khung cấu trúc, đây cũng là tín hiệu đặc trưng giúp xác định các phân nhóm trong nhóm flavonoid.
Proton tại δH 5,89 (H-6) tương quan với các carbon tại δC 96,2 (C-8), 103,4 (C-10), 165,5 (C-5) và 168,4 (C-7). Proton tại δH 5,91 (H-8) tương quan với các carbon tại δC 97,1 (C-6), 103,4 (C-10), 164,8 (C-9) và 168,4 (C-7).
Proton tại δH 6,96 (H-2') và proton tại 6,91 (H-6') cùng tương quan với carbon tại δC 80,3 (C-2).
Proton tại δH 3,86 (-OMe) tương quan với carbon tại δC 149,4 (C-4') giúp xác định được hợp chất CXQ03 mang bốn nhóm thể gồm: ba nhóm hydroxyl tại các vị trí C-5, C-7, C-5' và một nhóm methoxy tại vị trí C-4'.
Từ các dữ liệu vừa phân tích được, tiến hành phác thảo cấu trúc của hợp chất CXQ03 (Hình 4.11). Nhận thấy sự tương đồng về cấu trúc của CXQ03 và hesperetin, tiến hành lập bảng so sánh dữ liệu phổ để chứng minh độ chính xác của quá trình phổ nghiệm (Bảng 4.10). Nhận thấy sự tương đồng về cấu trúc và dữ liệu phổ nên có thể nhận danh CXQ03 chính là hesperetin.
Bảng 4.10: So sánh dữ liệu phổ của CXQ03 và hesperetin (Prakash et al., 2020) Vị trí
Hợp chất CXQ03
2 3 4 5 6 7 8 9 10
1' 2' 3' 4' 5' 6' 4'-OMe
*Đo trong MeOD, 1H-NMR 500 MHz, 13C-NMR 125 MHz.
**Đo trong DMSO-d6, 1H-NMR 400 MHz, 13C-NMR 100 MHz.
79
Hình 4.12: Hợp chất CXQ03 (hesperetin) 4.3.1.3 Cấu trúc hợp chất CXQ05
Hợp chất CXQ05 thu được có dạng bột màu vàng, tan hoàn toàn trong acetone, methanol, nhiệt độ nóng chảy 168-172°C. Vết sắc ký của hợp chất hấp thụ UV bước sóng 254 nm, hiện vết màu gạch tôm với thuốc thử vanillin/H2SO4 20% và vết màu xanh đen với thuốc thử Fe3+.
Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) có sự xuất hiện của:
Năm tín hiệu của proton nhóm olefin tại H 6,20 (1H, d, 2,5 Hz), 6,37 (1H, d, 2,5 Hz), 6,92 (1H, d, 8,5 Hz), 7,31 (1H, dd, 8,5; 2,0 Hz) và 7,34 (1H, d, 2,0 Hz). Trong đó, hai tín hiệu tại H 6,20 cùng 6,37 ppm ghép gặp vị trí meta với hằng số ghép cặp là 2,5 còn có tín hiệu proton tại H 7,31 ppm ghép cặp vị trí ortho cùng proton tại H 6,91 ppm với hằng số ghép cặp là 8,5 và ghép cặp vị trí meta cùng proton tại H 7,34 ppm với hằng số ghép cặp là 2,0. Kết hợp cùng các đặc tính vật lý của hợp chất, có thể kết luận đây chính là một flavonoid điển hình.
Ngoài ra tại vùng từ trường cao đến trung bình xuất hiện thêm 5 tín hiệu carbon nhóm oxymethine tại H 5,35 (1H, d, 1,5 Hz), 4,22 (1H, dd, 3,5; 2,0 Hz), 4,22 (1H, dd, 3,5; 2,0 Hz), 3,35 (1H, d, 9,5 Hz), 3,43 (1H, dd, 9,5; 6,0 Hz) và một tín hiệu proton nhóm methyl tại H 0,95 (3H, d, 6,0 Hz). Đây là các tín hiệu đặc trưng của phân tử đường rhamnoside với proton anomer tại H 5,35 ppm cho biết liên kết giữa nhánh và khung chính có cấu dạng α.
Từ dữ liệu phổ 1D-NMR vừa phân tích, có thể xác định CXQ05 là một flavonol liên kết với một phân tử đường rhamnoside qua cầu nối O-glycoside.
Phổ 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) kết hợp HSQC càng làm rõ cấu trúc của hợp chất với sự hiện diện của 14 tín hiệu carbon nhóm olefin tại C 93,3; 98,4;
104,5; 115,0; 115,6; 121,5 121,6; 134,9; 145,0; 148,4; 157,2; 157,9; 161,8 và 164,5 pmm. Trong đó, các carbon tại C 145,0; 148,4; 157,2; 157,9; 161,8 và 164,5 ppm là các carbon liên kết với nguyên tố có độ âm điện cao như oxygen.
Một tín hiệu carbon nhóm ketone tại C 178,3 ppm. Đây là các tín hiệu đặc trưng của các hợp chất thuộc nhóm flavonol.
80
Năm tín hiệu carbon nhóm oxymethine tại C 70,5; 70,6; 70,8; 71,9; 102,2 ppm cùng một tín hiệu carbon nhóm methyl tại C 16,3 ppm là các tín hiệu đặc trưng của phân tử đường rhamnoside với carbon anomer tại C 102,2 ppm cho biết liên kết giữa phân tử đường và khung chính có dạng O-glycoside.
Từ dữ liệu phổ 1D-NMR vừa phân tích, có thể xác định CXQ05 là một flavonol liên kết với một phân tử đường rhamnoside qua cầu nối O-glycoside.
Phổ HMBC của hợp chất cho thấy:
Proton anomer tại H 5,35 (H-1'') tương quan với các carbon tại C 70,8 (C- 5'') và 134,9 (C-3).
Proton tại H 6,20 (H-6) tương quan với các carbon tại C 93,3 (C-8), 104,5 (C-10), 161,8 (C-5) và 164,5 (C-7).
Proton tại H 6,37 (H-8) tương quan với các carbon tại C 98,4 (C-6); 104,5 (C-10), 157,2 (C-9) và 164,5 (C-7).
Proton tại H 7,34 (H-2') tương quan với các carbon tại C 121,6 (C-1'), 145,0 (C-3'), 148,4 (C-4') và 157,9 (C-2).
Proton tại H 7,31 (H-6') tương quan với carbon tại C 115,0 (C-5'), 148,4 (C-4') và 157,9 (C-2).
Các dữ liệu vừa phân tích ở phổ HMBC đã làm sáng tỏ và giúp nhận danh được cấu trúc chính là quercitrin (hình 4.12). Tiếp tục lập bảng so sánh dữ liệu phổ của hợp chất CXQ05 với dữ liệu phổ của quercitrin ở tài liệu tham khảo (Hasan et al., 2006) để khẳng định độ chính xác của kết quả phổ nghiệm (Bảng 4.11).
Hình 4.13: Công thức phân tử hợp chất CXQ05 (quercitrin)
81
Bảng 4.11: So sánh dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất CXQ05 với quercitrin (Hasan et al., 2006)
Vị Hợp chất CXQ5
trí
2 3 4 5 6 7 8 9 10
1’
2’
3’
4’
5’
6’
1”
2” 4,22 (1H, dd, 3,5; 2,0 Hz) 3”3,75 (1H, dd, 9,5; 3,0 Hz)
4”
5”3,43 (1H, dd, 9,5; 6,0 Hz) 6”
Đo trong dung môi MeOD, 1H-NMR 500 MHz, 13C-NMR 125 MHz.
Quercetin là hợp chất đã từng được phân lập từ cây cỏ xước (Tôn Nữ Liên Hương et al., 2012). Sau khi xác định công thức phân tử của các hợp chất phân lập được cho thấy quercetin (CXQ02), hesperetin (CXQ03) có hoạt tính ức chế enzyme XO với IC50 lần lượt là 14,6; 103,2 à
g/mL. Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Nagao et al. (1999). Nhóm nghiên cứu của Nagao đã công bố hợp chất quercetin có hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh và ức chế XO theo kiểu hỗn hợp. Hesperetin ức chế XO với hoạt tính yếu, vì thế các nghiên cứu bỏ qua việc xác định kiểu ức chế của hợp chất này.
Quercitrin (CXQ05) ức chế enzyme XO khỏ mạnh với IC50 là 37,7 à
g/mL.
Quercitrin có cấu trúc phân tử giống với quercetin và có gắn thêm nhóm -O-a-L- rhamnoside ở vị trí C3 (Hình 4.10 và 4.12). Có lẽ vì thế mà quercitrin có hoạt tính ức chế enzyme XO. Quercitrin là hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO mà trước đây chưa được công bố. Vì vậy, quercitrin được nghiên cứu tiếp về kiểu ức chế.
82