CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase
Sữa bò được thu từ Trại Nghiên cứu và Thực nghiệm Nông nghiệp - Khoa Nông nghiệp - trường Đại học Cần Thơ (Hình 3.2).
Hình 3.3: Sữa bò dùng để phân lập enzyme XO
Enzyme XO từ sữa bò được phân lập theo phương pháp của Massey et al.
(1969). Ba lít sữa bò tươi vừa vắt từ cơ thể bò được cho vào thùng lạnh, nhanh chóng mang về phòng thí nghiệm và tiến hành phân lập enzyme ở điều kiện 4°C.
Trước tiên, 3 L sữa bò tươi được cho thêm vào các chất lần lượt như sau: 7,5 mL EDTA 0,3 M, pH 7,0; 3 mL salicylate 1 M, pH 7,0; 3,6 g cysteineãHCl; 3 mL phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 M (được pha trong ethanol); 47,4 g Na2CO3; 4,74 g pancreatin. Hỗn hợp được khuấy trong 30 phút, sau đó để yên qua đêm ở 4°C.
Sau 24 giờ, hỗn hợp được thêm 0,6 kg (NH4)2SO4 và khuấy trong thời gian 1 giờ. Tiếp theo, hỗn hợp được thêm 0,5 L 1-butanol lạnh (-20°C), khuấy 30 phút và tiếp tục để yên hỗn hợp qua đêm ở 4°C.
Sau 24 giờ, hỗn hợp tách thành 2 lớp: lớp phía trên màu trắng chứa lipid, lớp dưới có dạng dung dịch màu vàng đậm chứa enzyme XO. Lớp màu trắng chứa lipid được bỏ đi, lớp dung dịch màu vàng đậm phía dưới được sử dụng để tiếp tục phân lập enzyme XO. Ba trăm sáu mươi gram (NH4)2SO4 được thêm vào 2,25 L dung dịch màu vàng đậm. Hỗn hợp được khuấy trong 30 phút và để yên
43
trong 1 giờ. Enzyme XO thô đông lại và nổi lên bề mặt, lớp chất lỏng phía dưới được loại bỏ. Phần enzyme XO thô tiếp tục được ly tâm 5.000 vòng/phút trong 20 phút. Sau khi ly tâm, hỗn hợp được phân thành 3 lớp: lớp chất lỏng phía trên, lớp chất rắn ở giữa và lớp chất lỏng khác ở phía dưới. Chất lỏng phía trên và phía dưới được loại bỏ, lớp chất rắn ở giữa được giữ lại để tiếp tục tinh sạch enzyme XO. Chất rắn sau ly tâm được cho vào thêm 45 mL dung dịch đệm phosphate 0,1 M; ethylenediaminetetraacetic acid 0,3 mM, salicylate 1 mM, phenylmethylsulfonyl fluoride 10 àM, pH 6,0 và thẩm tớch trong 72 giờ (Hỡnh 3.3). Sản phẩm sau thẩm tích được đông khô chân không và sau đó trữ ở -20°C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.4: Thẩm tích
Quy trình phân lập enzyme XO từ sữa bò được tóm tắt bằng sơ đồ Hình 3.4.
44
3 L sữa bò tươi
EDTA, salicylate, cysteineãHCl, PMSF, Na2CO3, pancreatin
Để qua đêm (NH4)2SO4
1-butanol
Để qua đêm
Lấy lớp dung dịch phía dưới
4°C (NH4)2SO4
1 giờ
Lấy phần nổi phía trên
20 phút Ly tâm 5.000 vòng/phút
Lấy phần rắn
Thẩm tích 72 giờ
Đông khô chân không
Enzyme XO (Bảo quản ở -20°C)
Hình 3.5: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập enzyme XO
3.2.1.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan trong hỗn hợp enzyme XO trích được theo phương pháp Folin-Lowry
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin-phenol tạo thành phức chất có màu xanh dương, hấp thu ánh sáng ở bước sóng 750 nm.
Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein.
Phương pháp tiến hành: Xây dựng dung dịch protein chuẩn với dãy nồng độ dung dịch bovine serum albumin (BSA) (BSA 1 mg/mL trong NaCl 0,9%): 0;
0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35 và 0,4 (mg/mL) (Bảng 3.1). Dùng thuốc thử 45
Folin cho thấy sự thay đổi màu của các dung dịch, dung dịch chứa màu càng đậm thì chứa hàm lượng protein càng cao. Đo độ hấp thu của từng dung dịch trên máy quang phổ và vẽ đường chuẩn về sự phụ thuộc của độ hấp thu A vào nồng độ dung dịch protein chuẩn.
Bảng 3.1: Bảng xây dựng đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry Ống nghiệm
Nồng độ protein (mg/mL)
Thể tích protein chuẩn (L)
Thể tích NaOH 0,01 N (L)
Thể tích kiềm (C) (mL) Thuốc thử Folin (mL)
Xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích: Lấy 0,5 mL dung dịch cần xác định hàm lượng protein (1 mg/mL trong NaOH 0,01 N) cho vào ống nghiệm, cho thêm 5,5 mL dung dịch kiềm C (xem phụ lục). Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Tiếp tục cho thêm 0,5 mL thuốc thử Folin 0,5 N rồi lắc đều, dung dịch protein sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh nước biển, để yên 30 phút và đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 750 nm. Dựa vào đường chuẩn suy ra được nồng độ protein trong mẫu tương ứng (Lowry et al., 1951).
3.2.1.3 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
Phõn tớch điện di SDS-PAGE được thực hiện theo phương phỏp của ệzer et al. (1999) với gel polyacrylamide 6%.
Nguyên tắc: điện di SDS-PAGE là kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide có sự hiện diện của chất gây biến tính SDS (Sodium Dodecyl Sulphate). Các phân tử SDS mang điện âm sẽ tương tác với protein và bám dọc chiều dài phân tử. Phân tử protein hoàn toàn tích điện âm và dịch chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương. Chất khử beta-mercaptoethanol khử cầu nối disulfite trong phân tử protein.
46
Các tiểu đơn vị trong hỗn hợp enzyme có cùng mật độ điện tích và cùng di chuyển trong một điện trường như nhau. Khi đó tốc độ di chuyển trong điện trường của enzyme phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử và độ tinh sạch của sản phẩm.
Gel điện di gồm 2 lớp:
- Lớp gel tập trung: Nằm ở trên, giúp tập trung protein tạo thành một băng. Lớp gel tập trung này có kích thước lỗ rất lớn (acrylamide 4%) cho phép protein di chuyển nhanh và tập trung lại dưới tác dụng của điện trường.
- Lớp gel phân tích: Nằm ở dưới, giúp các protein từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu phân tách nhau theo trọng lượng phân tử.
3.2.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập Hoạt tính của enzyme XO được xác định bằng phương pháp quang phổ của Bergmeyer (1974).
Nguyên tắc: Hoạt tính của enzyme XO phân lập từ sữa bò được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành theo phản ứng:
Xanthine + O2 + H2O
Lượng acid uric tạo thành được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 290 nm.
Phương pháp:
Hỗn hợp phản ứng gồm 1,9 mL dung dịch đệm phosphate (pH 7,5), 1 mL xanthine nồng độ 0,15 mM và 0,1 mL enzyme XO nồng độ 1 mg/mL. Mẫu trắng được thực hiện trong điều kiện không có enzyme, dung dịch enzyme được thay thế bằng dung dịch đệm với cùng thể tích. Phản ứng được thực hiện trong cuvette thạch anh có độ dày 1 cm. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 25°C. Thời gian phản ứng
(T)được tính từ lúc cho enzyme vào hỗn hợp mẫu thử đến khi giá trị hấp thu tia UV bắt đầu không tăng thêm nữa. Độ hấp thu tia UV được đo trên máy Jasco V- 730 ở bước sóng 290 nm.
47
Hoạt tính của enzyme được tính bằng công thức:
(Amẫu thử - Amẫu trắng)3
C = 12,20,1T
Hoạt tính riêng của enzyme được tính theo công thức:
S = C
P
Hoạt tính của enzyme có trong 1 mg enzyme thô ở thể rắn được tính theo công thức:
R = C D
Trong đó:
A: độ hấp thu quang phổ lớn nhất của mẫu trong thời gian phản ứng.
12,2: hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sóng 290 nm (mM-1.cm-1) 3:thể tích hỗn hợp phản ứng
(mL) 0,1: thể tích enzyme cho vào (mL) T: thời gian phản ứng
C: hoạt tính của enzyme (U/mL enzyme) S: hoạt tính riêng của enzyme (U/mg protein)
P: khối lượng protein có trong 1 mL dung dịch enzyme (mg protein/mL enzyme) R: Số đơn vị hoạt tính có trong 1 mg enzyme thô ở thể rắn (U/mg enzyme thô) D: Khối lượng enzyme thô ở thể rắn đã hòa tan trong 1 mL dung dịch enzyme (mg enzyme thô/mL enzyme)
3.2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên enzyme xanthine oxidase trích được
Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của enzyme XO được thực hiện tương tự như thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme XO theo phương pháp của Bergmeyer (1974). Thí nghiệm gồm 2 nhân tố là pH với các mức độ pH 6,5; 7; 7,5 và 8,0; và nhiệt độ ở các mức độ 20, 25, 30 và 35°C.
3.2.1.6 Khảo sát nồng độ xanthine và xanthine oxidase phù hợp cho phản ứng
Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 96 giếng Costar 3635 dựa theo phương pháp của Nguyen et al. (2004). Nồng độ xanthine và enzyme XO phù hợp được chọn dựa vào hiệu suất phản ứng tạo thành acid uric từ xanthine, với sự xúc tác của enzyme XO ở nhiệt độ 25°C và pH 7,5 (xác định từ thí nghiệm trên). Hỗn hợp trong mỗi giếng thử bao gồm: 85 àL dung dịch đệm phosphate (0,05 M; pH 7,5), 60 àL xanthine, 30 àL enzyme XO, sau 30 phỳt cho thờm 25 àL HCl 1 N.
Dung dịch xanthine được sử dụng trong thí nghiệm với các nồng độ 0; 0,075;
0,15; 0,3 và 0,6 mM. Dung dịch enzyme XO được sử dụng với các nồng độ 0;
48
0,005; 0,01; 0,02 và 0,04 U/mL. Song song với mỗi mẫu thử có một mẫu trắng.
Mẫu trắng là mẫu được thực hiện tương tự như mẫu thử, nhưng HCl được cho vào trước enzyme. Độ hấp thu của lượng acid uric mới tạo thành trong phản ứng bằng độ hấp thu của mẫu thử trừ đi độ hấp thu của mẫu trắng tương ứng. Từ độ hấp thu của lượng acid uric mới tạo thành trong phản ứng, dựa vào đường chuẩn acid uric sẽ xác định lượng acid uric tạo thành. Mỗi phản ứng được thực hiện lặp lại 3 lần. Các nghiệm thức của thí nghiệm được bố trí theo kiểu thừa số 2 nhân tố:
nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO.
Hiệu suất phản ứng tạo thành acid uric từ xanthine dưới sự xúc tác của enzyme XO được tính theo công thức sau:
Hiệu suất phản ứng (%) =
So sánh hiệu suất phản ứng giữa các nghiệm thức để chọn nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO phù hợp để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Đường chuẩn acid uric được xác định như sau: acid uric được pha trong dung dịch đệm phosphate (0,05 M; pH 7,5) thành các nồng độ 0,025; 0,05, 0,1;
0,2; 0,4 và 0,6 mM. Thí nghiệm được khảo sát trong đĩa 96 giếng với thể tích dung dịch cho vào giếng là 200 àL. Mẫu trắng là mẫu chứa 200 àL dung dịch đệm phosphate. Dung dịch acid uric được đo ở bước sóng 290 nm. Độ hấp thu tia UV của acid uric trong hỗn hợp là độ hấp thu tia UV chênh lệch giữa các mẫu so với mẫu trắng. Sử dụng độ hấp thu tia UV của acid uric ở các nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn acid uric.
3.2.1.7 So sánh hoạt tính của enzyme xanthine oxidase phân lập từ sữa bò và enzyme xanthine oxidase thương mại
Khả năng ức chế enzyme XO (được phân lập từ sữa bò) của AP được thực hiện trên đĩa 96 giếng dựa vào lượng acid uric tạo thành (Nguyen et al., 2004;
Anam et al., 2017). Hỗn hợp trong mỗi giếng thử bao gồm: 50 àL dung dịch AP, 35 àL dung dịch đệm phosphate, 30 àL dung dịch enzyme XO 0,02 U/mL, ủ ở điều kiện 25°C trong 15 phỳt, tiếp theo cho thờm 60 àL dung dịch xanthine 0,15 mM ủ ở 25°C trong 30 phỳt. Sau đú, 25 àL HCl 1 N được thờm vào để cố định mẫu. Cuối cùng mẫu được đo ở bước sóng 290 nm để xác định lượng acid uric tạo thành. Các giếng thử là các giếng có nồng độ AP với các nồng độ lần lượt là:
2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 và 20 àg/mL. Giếng sử dụng AP với nồng độ 0 àg/mL được xem là giếng đối chứng. Tương ứng với mỗi giếng thử cú một giếng trắng thử, tương ứng với giếng đối chứng có một giếng trắng đối chứng được thực hiện. Giếng trắng là giếng được thực hiện tương tự như giếng thử. Tuy
49
nhiên, HCl được cho vào giếng trước khi cho enzyme XO vào. Mỗi giếng được thực hiện lặp lại 3 lần. Từ kết quả của thí nghiệm này, đường chuẩn theo phần trăm enzyme XO bị ức chế bởi AP được xây dựng.
Khả năng ức chế enzyme XO thương mại của AP cũng được thực hiện tương tự như trên. Dựa trên cơ sở đó, hiệu quả ức chế của AP đối với enzyme XO được phân lập từ sữa bò và enzyme thương mại được so sánh với nhau.
Phần trăm ức chế được tính theo công thức I (%) = [(
Ađối chứng -
Athử)/
Ađối chứng]100 Trong đó:
Ađối chứng : Là độ hấp thu quang phổ của mẫu đối chứng Athử: Là độ hấp thu quang phổ của mẫu thử
Ađối chứng= Ađối chứng – A mẫu trắng của mẫu đối chứng
Athử= Athử - Amẫu trắng của mẫu thử