4.2 Khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của 8 loại thảo dược
4.2.2 Khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cao tổng ethanol được chiết từ 8 loại thảo dược
Tám loại cao chiết ethanol của các thảo dược được nghiên cứu bao gồm:
Húng chanh, kinh giới, râu mèo, sương sáo, dền gai, nở ngày, nở ngày đất và cỏ xước. Việc lựa chọn các thảo dược trên đưa vào sàng lọc vì các lý do sau đây:
Một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy trong cây húng chanh, kinh giới có chứa luteolin; trong cây kinh giới, râu mèo có chứa acid caffeic; trong cây húng chanh, dền gai, nở ngày, cỏ xước có chứa quercetin (Stintzing et al., 2004;
Roshan et al., 2010; Tôn Nữ Liên Hương và ctv., 2012; Arthi and Prasanna, 2016;
Hoàng Đức Thuận và ctv., 2017; Pudziuvelyte et al., 2020). Một số nghiên cứu khác lại khẳng định acid caffeic, luteolin và quercetin có tác dụng ức chế enzyme XO (Chiang et al., 1994; Nagao et al., 1999). Bên cạnh đó, cây sương sáo và cây nở ngày đất là những thảo dược được dân gian sử dụng để điều trị bệnh khớp và bệnh gout. Tuy nhiên cho đến nay, các thảo dược này vẫn là đối tượng mới trong việc nghiên cứu về khả năng ức chế enzyme XO.
Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây nở ngày, húng chanh và dền gai được thể hiện qua Bảng 4.3.
Bảng 4.3: Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây nở ngày, húng chanh và dền gai
Nồng độ cao chiết (àg/mL)
0 6,25 12,5 25 50 100 200 400 800 P CV (%)
Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê SD (standard deviation): độ lệch chuẩn
P: xác xuất không xảy ra bộ số liệu khi làm thí nghiệm. Thí nghiệm được chấp nhận khi P ≤ 0,05;
*: P nằm trong khoảng 0,01-0,05; **: P<0,01
CV: Độ dao động của số liệu. Chỉ số CV càng nhỏ thì độ tin cậy càng cao.
68
Kết quả cho thấy cao ethanol cây nở ngày với các nồng độ 0; 6,25; 12,5; 25;
50; 100 àg/mL khụng cú khả năng ức chế enzyme XO. Cao ethanol cõy nở ngày với nồng độ 200; 400 và 800 àg/mL thỡ trung bỡnh phần trăm enzyme XO bị ức chế chưa đạt 1%. Kết quả trên cho thấy cao chiết ethanol cây nở ngày gần như không có khả năng ức chế enzyme XO ở các nồng độ khảo sát.
Cao ethanol cây húng chanh với các nồng độ 0; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200 àg/mL khụng cú khả năng ức chế enzyme XO. Cao ethanol cõy hỳng chanh với nồng độ 400 và 800 àg/mL thỡ trung bỡnh phần trăm enzyme XO bị ức chế lần lượt là 4,79 và 6,96%. Kết quả trên cho thấy cao chiết ethanol cây húng chanh cũng gần như không có khả năng ức chế enzyme XO ở các nồng độ khảo sát.
Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây dền gai tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết khi tăng dần nồng độ cao chiết từ 0 đến 800 àg/mL. Trong cỏc nồng độ khảo sát, nồng độ cao chiết càng cao thì khả năng ức chế enzyme XO càng mạnh thể hiện ở sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về phần trăm ức chế enzyme giữa cỏc nồng độ cao chiết. Đặc biệt ở nồng độ cao chiết 800 àg/mL, tỉ lệ enzyme XO bị ức chế là 42,7%, chưa đạt 50%. Vì vậy, với dãy nồng độ cao chiết đã khảo sát, chưa xác định được IC50 của cao chiết.
Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây sương sáo, râu mèo và kinh giới được thể hiện ở Bảng 4.4.
Bảng 4.4: Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây sương sáo, râu mèo và kinh giới
Nồng độ cao chiết (àg/mL)
6,25 12,5 25 50 100 200 400 800 P CV (%)
Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê SD (standard deviation): độ lệch chuẩn
P: xác xuất không xảy ra bộ số liệu khi làm thí nghiệm. Thí nghiệm được chấp nhận khi P ≤ 0,05;
*: P nằm trong khoảng 0,01-0,05; **: P<0,01
CV: Độ dao động của số liệu. Chỉ số CV càng nhỏ thì độ tin cậy càng cao.
69
Kết quả cho thấy, khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây sương sáo tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết khi tăng dần nồng độ cao chiết từ 0 đến 800 àg/mL. Trong dóy nồng độ khảo sỏt, nồng độ cao chiết càng cao thỡ khả năng ức chế enzyme XO càng mạnh thể hiện ở sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về phần trăm ức chế enzyme giữa các nồng độ cao chiết. Phương trình đường chuẩn về khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây sương sáo là y=0,1124x+24,996 (Hình 4.7). Từ phương trình đường chuẩn này suy ra được nồng độ cao ethanol cõy sương sỏo cú tỏc dụng ức chế 50% enzyme XO (IC50) là 222 àg/mL.
Cao ethanol cõy rõu mốo ở nồng độ 6,25 àg/mL thỡ phần trăm ức chế đạt 26,6%. Khi tăng nồng độ cao lờn 12,5; 25; 50; 100; 200 và 400 àg/mL thỡ hiệu quả ức chế enzyme XO tăng lần lượt là 31,2%; 34,9%; 39,7%; 45,6%; 56,5% và 62,2%. Tuy nhiờn, khi tiếp tục tăng nồng độ cao chiết từ 400 àg/mL lờn 800 àg/mL thỡ khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết khụng thay đổi 62,2%.
Đường chuẩn khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết cây râu mèo có phương trình là y=0,1414x+29,806 (Hình 4.7). Từ phương trình đường chuẩn này suy ra được nồng độ cao ethanol cây râu mèo có tác dụng ức chế 50% (IC50) enzyme XO là 143 àg/mL.
Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây kinh giới tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết khi tăng dần nồng độ cao chiết từ 0 đến 400 àg/mL. Ở giai đoạn này, nồng độ cao chiết càng cao thì khả năng ức chế enzyme XO càng mạnh thể hiện ở sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về phần trăm ức chế enzyme giữa các nồng độ cao chiết. Cụ thể là, ở nồng độ cao chiết 6,25 àg/mL thỡ phần trăm ức chế đạt 0,65%. Khi tăng nồng độ cao lờn 12,5; 25; 50; 100; 200 và 400 àg/mL thỡ hiệu quả ức chế enzyme XO tăng lần lượt là 26,3%; 30,2%; 41,9%; 46,3%;57,6%
và 71,1%. Tuy nhiờn, khi tiếp tục tăng nồng độ cao chiết từ 400 àg/mL lờn 800 àg/mL thỡ khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết khụng thay đổi. Cụ thể là phần trăm ức chế giữa 2 nồng độ 400 và 800 àg/mL là 71,1% và 70,7% khỏc biệt không có ý nghĩa thống kê. Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Nguyen et al., (2004). Nhóm tác giả này đã cho thấy cao chiết methanol-nước của cõy kinh giới với cỏc nồng độ 25, 50 và 100 àg/mL cú tỏc dụng ức chế enzyme XO với phần trăm ức chế lần lượt là 29,2; 42,8 và 43,3 àg/mL.
Phương trình đường chuẩn khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol kinh giới có dạng y=0,157x+28,292 (Hình 4.7). Từ phương trình đường chuẩn này suy ra được nồng độ cao ethanol cây kinh giới có tác dụng ức chế 50% (IC50) enzyme XO là 138 àg/mL.
70
Hình 4.8: Đồ thị tuyến tính khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây cỏ xước, nở ngày đất, râu mèo, kinh giới và sương sáo Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây nở ngày đất và cây cỏ xước được trình bày trong Bảng 4.5.
Bảng 4.5: Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây nở ngày đất và cây cỏ xước
Nồng độ cao chiết (àg/mL)
0 6,25 12,5 25 50 100 200 400 800 P CV (%)
Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê SD (standard deviation): độ lệch chuẩn
P: xác xuất không xảy ra bộ số liệu khi làm thí nghiệm. Thí nghiệm được chấp nhận khi P ≤ 0,05;
*: P nằm trong khoảng 0,01-0,05; **: P<0,01
CV: Độ dao động của số liệu. Chỉ số CV càng nhỏ thì độ tin cậy càng cao.
Kết quả cho thấy, khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol nở ngày đất tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết. Khi tăng nồng độ cao chiết từ 6,25; 12,5; 25;
100; 200 μg/mL hiệu quả ức chế tăng có ý nghĩa thống kê. Ở nồng độ cao chiết 200 μg/mL thì hiệu suất ức chế enzyme đạt cao nhất là 86,9±1,14%. Ở mức nồng
71
độ 6,25 μg/mL hiệu quả ức chế là 21,4±0,252%. Khi tăng nồng độ cao chiết từ 12,5 lên đến 25; 50; 100; 200 μg/mL thì enzyme bị ức chế cũng tăng, hiệu suất ức chế lần lượt là 29,1±0,755; 45,8±1,46; 60,3±6,9; 81,8±1,14 và 86,9±1,14%. Kết quả này chứng tỏ cao chiết ethanol nở ngày đất có hoạt tính ức chế enzyme XO.
Ởnồng độ cao chiết 400 và 800 μg/mL thì hiệu quả ức chế khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với ở nồng độ cao chiết 200 μg/mL là 86,9±1,14%. Điều này có thể kết luận rằng, ở nồng độ cao chiết 200 μg/mL đã ức chế tối đa lượng enzyme XO trong phản ứng. Khả năng ức chế hoạt động enzyme XO của cao chiết ethanol nở ngày đất chỉ đạt giá trị nhất định.
Hàm lượng chất ức chế enzyme XO có trong cao chiết ethanol nở ngày đất tính tương đương mM AP tương ứng với cao chiết ở các nồng độ 6,25; 12,5; 25;
50; 100; 200; 400 và 800 mg/mL là 3,89±0,46; 5,34±0,14; 8,48±0,28; 11,2±1,3;
15,3±0,212; 16,2±0,216; 16,1±0,121 và 16,2±0,04 μg/mL (Bảng 4.5).
Đường chuẩn về khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol nở ngày đất có phương trình y=0,6197x+23,667 (Hình 4.7). Từ phương trình này suy ra được nồng độ cao ethanol cây nở ngày đất ức chế 50% enzyme XO là 42,5 μg/mL.
Đối với cao ethanol cây cỏ xước, nồng độ cao chiết càng cao thì khả năng ức chế enzyme XO càng mạnh và ngược lại. Khả năng ức chế enzyme XO ở các nồng độ cao chiết 6,25; 12,5; 18,75; 25; 50 và 100 μg/mL khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,01). Ở nồng độ cao chiết 6,25 μg/mL thì hiệu suất ức chế enzyme là 14,4±0,1%. Khi tăng nồng độ cao chiết từ 12,5 lên đến 18,75; 25; 50; 100 μg/mL thì hiệu suất ức chế cũng tăng, hiệu suất ức chế lần lượt là 40,3±1,3;
53,4±0,681; 70,2±1,68; 80±0,902 và 90,6±2,35 %. Điều này cho thấy, cao chiết ethanol cỏ xước có khả năng ức chế enzyme XO. Ở nồng độ cao chiết 100; 200; 400 và 800 μg/mL thì hiệu quả ức chế khác biệt không có ý nghĩa thống kê lần lượt là 90,6±2,35; 89,5±1,18; 88,7±0,917 và 89,8±0,462%. Có thể kết luận rằng, nồng độ cao chiết 100 μg/mL đã ức chế enzyme XO trong phản ứng đến mức tối đa.
Hàm lượng chất ức chế enzyme XO có trong cao chiết ethanol cỏ xước tính tương đương mM AP tương ứng với nồng độ cao ở các nồng độ 6,25; 12,5;
18,75; 25; 50; 100; 200; 400 và 800 mg/mL là 2,59±0,015; 7,43±0,243; 9,9±0,125;
13±0,312; 14,8±0,17; 16,8±0,441; 16,6±0,225; 16,5±0,168 và 16,7±0,087 μg/mL (Bảng 4.5).
Đường chuẩn khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cỏ xước có phương trình là y=2,8699x-0,22 (Hình 4.7). Từ phương trình này suy ra được nồng độ cao ethanol cỏ xước có tác dụng ức chế 50% enzyme XO là 17,5 μg/mL.
72
Các cao chiết đã xác định được IC50 bao gồm kinh giới, râu mèo, sương sáo, nở ngày đất và cỏ xước. Ở các nồng độ thấp, khả năng ức chế enzyme XO của các cao chiết tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết khi tăng dần nồng độ cao chiết.
Nồng độ cao chiết càng cao thì khả năng ức chế enzyme XO càng mạnh thể hiện ở sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về phần trăm ức chế enzyme giữa các nồng độ cao chiết. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ cao chiết đến một nồng độ nhất định thì khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết không tăng thêm nữa. Điều này cho thấy mỗi loại cao chiết có khả năng ức chế hoạt động enzyme XO tối đa chỉ đạt một giá trị nhất định. Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol 8 loại thảo dược được trình bày trong Hình 4.8.
Hình 4.9: Khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại cao chiết
Giá trị IC50 được dùng để so sánh khả năng ức chế enzyme XO giữa các cao chiết thảo dược. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu khảo sát mà tại đó nó có thể ức chế 50% enzyme. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp. Giá trị IC50 của các thảo dược được trình bày trong Bảng 4.6.
Bảng 4.6: Giá trị IC50 của các thảo dược khảo sát Thảo dược
Sương sáo Cây râu mèo Kinh giới Nở ngày đất Cỏ xước AP P CV (%)
Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê SD (standard deviation): độ lệch chuẩn
P: xác xuất không xảy ra bộ số liệu khi làm thí nghiệm. Thí nghiệm được chấp nhận khi P ≤ 0,05;
*: P nằm trong khoảng 0,01-0,05; **: P<0,01
CV: Độ dao động của số liệu. Chỉ số CV càng nhỏ thì độ tin cậy càng cao.
73
Kết quả cho thấy, cao ethanol cây sương sáo, cây râu mèo và cây kinh giới có IC50 lần lượt là 222±2,95, 142,7±3,91 và 138,1±1,56 μg/mL. Cao ethanol nở ngày đất và cao ethanol cỏ xước có tác dụng ức chế enzyme XO mạnh, với IC50 lần lượt là 42,6±2,94 và 17,5±0,1 μg/mL. Đây là 2 cao chiết được đề tài quan tâm, đặc biệt là cao ethanol cỏ xước, cao chiết có tác dụng ức chế enzyme XO mạnh nhất trong các cao chiết khảo sát. IC50 của đối chứng dương AP là 9,24±0,275 μg/mL. Một số thảo dược có tác dụng ức chế mạnh enzyme XO đã được xác định như cao chiết methanol cây ngãi cứu (Artemisia vulgaris), tô mộc (Caesalpinia sappan), đại bi (Blumea balsamifera), cúc (Chrysanthemum sinense) và chặc chìu (Tetracera scandens) có hoạt tính ức chế 50% enzyme XO dưới 20 àg/mL. IC50 của đối chứng dương AP là 2,5 àM (Nguyen et al., 2004).
Chiết xuất từ methanol của lá cây ngũ trảo (Vitex Negundo L.) và lá cây cà độc dược (Datura metel L.) có nồng độ ức chế 50% enzyme lần lượt là IC50 = 78,5 μg/mL và IC50 = 76,8 μg/mL (Umamaheswari et al., 2007).
Trong cây cỏ xước có chứa các chất thuộc nhóm flavonoid, đặc biệt là có chứa quercetin (Tôn Nữ Liên Hương et al., 2012, Sharma et al., 2013). Nhiều hợp chất thuộc nhóm flavonoid trong đó có quercetin có tác dụng ức chế enzyme XO khá tốt (Nagao et al., 1999). Chính vì thế, cao chiết cỏ xước có tác dụng ức chế mạnh enzyme XO là điều hợp lí. Vì vậy, cao chiết ethanol cỏ xước được chọn làm đối tượng để nghiên cứu tiếp.