1.2. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE
1.2.3. Kỹ thuật tách chiết alginate từ rong nâu
Trong rong nâu, alginate có ở thành tế bào và chủ yếu tồn tại dưới dạng các muối calcium, magie và sodium. Khi tồn tại ở dạng với muối của các ion kim loại hóa trị II (calcium và magie) thì alginate không tan trong nước, tuy nhiên alginate lại hòa tan được trong nước khi nó tồn tại dưới dạng muối với ion kim loại hóa trị I (sodium, potassium).
Do đó người ta dựa vào đặc tính trên để chiết alginate ra khỏi tế bào rong. Điểm mấu chốt căn bản trong quá trình chiết tách alginate từ rong biển là chuyển hóa tất cả muối alginate về dạng muối sodium, hòa tan trong nước và loại bỏ cặn rong biển bằng phương pháp lọc, sau đó alginate cần được thu hồi từ dịch lọc. Hiện có hai con đường thu hồi
alginate: con đường thứ nhất là thêm acid để tạo thành gel acid alginic không tan trong nước và tách nó dưới dạng rắn ra khỏi nước. Alginic acid được tách ra dưới dạng gel mềm và một phần lượng nước cần phải được loại khỏi chúng. Sau công đoạn này cồn được đưa vào acid alginic, tiếp theo là dùng sodium carbonate để chuyển hóa acid alginic về sodium alginate. Sodium alginate không hòa tan trong hỗn hợp cồn-nước nên có thể tách chúng ra khỏi hỗn hợp, làm khô, nghiền đến kích thước hạt thích hợp phụ thuộc vào từng ứng dụng riêng của nó. Con đường thứ 2 thu hồi sodium alginate là thêm vào dung dịch chiết ban đầu một muối calcium. Nó tác dụng tạo thành gel calcium alginate với một kết cấu dạng sợi, không hòa tan trong nước và có thể tách ra khỏi chúng.
Calcium alginate tách ra nằm lơ lửng trong nước và acid được thêm vào để chuyển hóa thành alginic acid. Acid alginic dạng sợi này được tách ra rất dễ và đặt vào trong một máy trộn hình cầu với cồn và sodium carbonate được đưa từ từ vào bột nhão cho đến khi tất cả acid alginic được chuyển hóa về sodium alginate, bột sodium alginate đôi khi còn được ép thành những viên nhỏ sau đó sấy và nghiền mịn [98].
1.2.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Alginate lần đầu tiên được nhà hóa học người Anh E. C. Stanford nghiên cứu tách chiết từ rong nâu vào cuối thế kỷ 18 (1881) và gọi là algin. Nhưng mãi đến năm 1923 nghiên cứu về alginate mới bắt đầu phát triển khi Thornley sử dụng alginate để làm chất kết dính các bụi than tạo thành dạng bánh than. Năm 1926, Thornley chuyển công ty đến San Diego, California và sử dụng alginate trong sản xuất các bình kín và sau đó đổi tên công ty thành Kelp Products Corp. Năm 1929, Kelp Products Corp tổ chức sắp xếp lại lấy tên là Kelco Company và từ đó alginate bắt đầu được sản xuất ở qui mô công nghiệp. Ở Anh Quốc, sản xuất alginate được tiến hành trong giai đoạn 1934 ÷ 1939, còn ở Na Uy thì sản xuất alginate được tiến hành chỉ vài năm sau chiến tranh thế giới lần thứ 2 [150].
Nghiên cứu tách chiết alginate đã được thế giới nghiên cứu công bố với các thông số kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào phương pháp chiết, loại rong, …. Theo Patent sáng chế của Arne Haug, thì qui trình sản xuất alginate như sau: rong được khuấy đảo trong 2% CaCl2 trong 1 giờ, rửa sạch bằng nước khử ion, tiếp tục xử lý với 40% formaldehyde trong 2 giờ. Sau đó rửa 3 lần bằng nước khử ion. Tiếp tục nấu chiết bằng 5% Na2CO3
trong 48 giờ, lọc bằng vải mỏng rồi kết tủa bằng ethanol, kết tủa được rửa sạch bằng acetone và sấy khô ở 60oC [94]. Mc Hugh (1987) đưa ra chế độ nấu chiết alginate đối
với một số loài rong thương mại: nồng độ sođa khoảng 1,5%, nhiệt độ nấu chiết từ 50 ÷ 95oC, thời gian nấu chiết từ 1 ÷ 2 giờ [150]. Rodolfo và cộng sự (1993) có nghiên cứu chiết rút alginate từ loài rong Sargassum ở Philippine và đề xuất chế độ chiết alginate:
nồng độ sođa là 3%, nhiệt độ chiết 50oC, thời gian chiết là 2 giờ [180]. Cũng với loài rong Sargassum của Philippine nhưng Calumpong và cộng sự (1999) đã đưa ra quy trình tách chiết alginate như sau: 20 gam rong khô được ngâm trong 800 mL formaldehyde 2% suốt 24 giờ ở nhiệt độ phòng, rửa bằng nước sạch rồi tiếp tục thêm vào 800 mL dung dịch HCl 0,2M rồi để trong 24 giờ. Sau đó, mẫu được rửa sạch bằng nước deion hóa trước khi tách chiết với 2% Na2CO3 ở 100oC trong 3 giờ. Ly tâm tách dịch chiết rồi kết tủa bằng ethanol 95% với thể tích gấp 3 lần thể tích dịch chiết. Sodium alginate được rửa hai lần với 100 mL acetone, sấy ở 65oC. Sodium alginate được hòa tan lại trong 100 mL nước deion hóa, kết tủa lặp lại với ethanol 95% với thể tích gấp 3 lần thể tích dịch sodium alginate, rửa bằng acetone rồi sấy ở 65oC thu được sodium alginate khô [47].
Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nấu chiết đến độ nhớt và trọng lượng phân tử alginate cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu: theo nghiên cứu của Vauchel và cộng sự (2008) thấy rằng khi chiết alginate trong môi trường kiềm thì thời gian chiết làm giảm đáng kể độ nhớt và trọng lượng phân tử của alginate. Cụ thể khi thay đổi thời gian chiết từ 1 ÷ 4 giờ thì độ nhớt alginate giảm gần 20% và khối lượng phân tử trung bình của alginate giảm khoảng 17,6% (từ 91,902 kDa xuống còn 16,154 kDa) [211]. Nhóm tác giả cũng đã đưa ra phương pháp mới để tách chiết alginate từ rong Laminaria digitata, theo như phương pháp của các tác giả trước đây trong bước tách chiết bằng kiềm theo phương pháp chiết theo mẻ (gián đoạn) sẽ mất nhiều thời gian, tiêu hao nhiều nước và hóa chất, thì trong nghiên cứu mới của tác giả sử dụng phương pháp chiết đùn phản ứng liên tục, kết quả cho thấy hiệu quả hơn do thời gian giảm từ 1 giờ còn chỉ vài phút, lượng nước và hóa chất sử dụng giảm hơn 1/2, hiệu suất cao hơn 15%, các tính chất lưu biến của sản phẩm được tăng cường. Vì thế phương pháp này có thể đưa vào sản xuất alginate công nghiệp để sản xuất alginate có tính chất lưu biến cao [212]. Còn nghiên cứu của Chou và cộng sự (1977) thấy rằng quá trình tách chiết alginate từ rong nâu với nồng độ sođa 3% thì độ nhớt alginate giảm đáng kể so với nồng độ sođa 1%; nhiệt độ chiết ở 20oC cho hiệu suất chiết và độ nhớt của alginate thấp hơn so với nhiệt độ chiết từ 50 ÷ 70oC [54].
Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng, độ nhớt và khối lượng phân tử của
alginate được tác giả Chee và cộng sự (2011) nghiên cứu trên 4 loại rong nâu của Malaysia (S. baccularia, S. binderi, S. siliquosum và T. conoides) được lấy từ cảng Dickson thuộc bang Negeri Sembilan. Alginate được tách chiết bằng 2 phương pháp:
nóng và lạnh. Với phương pháp chiết nóng, thời gian chiết alginate là 3 giờ ở nhiệt độ 50oC còn với phương pháp chiết lạnh thì quá trình chiết tiến hành qua đêm ở nhiệt độ phòng 27oC. Hàm lượng alginate chiết tách bằng phương pháp nóng cao hơn phương pháp chiết lạnh, nhưng phương pháp chiết lạnh cho alginate có độ nhớt và khối lượng phân tử lớn hơn. Hàm lượng alginate thu được theo phương pháp chiết nóng từ các loại rong S. siliquosum, T. conoides, S. binderi và S. baccularia tương ứng là 49%, 41,4%, 38,9% và 26,7%, nhưng với phương pháp chiết lạnh thì hàm lượng alginate chỉ đạt tương ứng là 38,9%, 40,5%, 28,7% và 23,9%. Bên cạnh đó, nhóm tác giả nghiên cứu cũng cho rằng, so với phương pháp chiết ở nhiệt độ thường thì khi chiết alginate ở nhiệt độ 50oC cũng làm giảm độ nhớt nội của alginate, cụ thể là độ nhớt nội của rong S. baccularia giảm mạnh nhất (83%), tiếp theo là rong S. siliquosum (16%), độ nhớt nội của 2 loài rong S. binderi và T. conoides giảm ít hơn trong khoảng 13 ÷ 14%. Khối lượng phân tử alginate cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, đối với rong S. baccularia, khối lượng phân tử alginate giảm trên 83% do ảnh hưởng của nhiệt độ, 3 loại rong còn lại thì khối lượng phân tử của alginate giảm từ 13% đến 16% do ảnh hưởng của nhiệt độ cao [51].
Khi nghiên cứu tách chiết alginate, Finn Hjelland (2010) thấy rằng các loài rong Alginophytes ngoài alginate, fucoidan và laminaran chúng còn có chứa acid mannuronic có hoạt tính kích thích hệ miễn dịch. Vì vậy, tác giả đã xây dựng quy trình chiết rút alginate kết hợp với việc thu hồi mannuronic acid bằng cách thay đổi pH phù hợp với quá trình xử lý rong trước khi chiết rong bằng sođa [103].
Nghiên cứu tách chiết alginate ở qui mô pilot được nghiên cứu bởi Hernández- carmona và cộng sự (1998): trước khi xử lý acid, dùng formaldehyde 0,1% xử lý rong.
Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng formaldehyde thì sản phẩm ít có màu, có thể làm cho ion calcium từ 33,4% đến gần 0, hiệu suất chiết alginate 7%. Độ mạnh của acid khi xử lý tỷ lệ thuận với sự thay đổi tỷ lệ calcium nhưng tỷ lệ nghịch với độ nhớt alginate thu được. Với acid mạnh độ nhớt đo được là 168 cP, trong khi đó nếu sử dụng các acid trung bình, độ nhớt đo được là 623 cP [97]. Theo một nghiên cứu khác cũng của nhóm tác giả trên vào năm 1999 đã xác định được điều kiện chiết tách alginate tốt nhất trong môi trường kiềm ở pH = 10, nhiệt độ 80oC trong thời gian 2 giờ. Tỷ lệ thu alginate tăng
theo thời gian chiết và đạt cao nhất sau khi chiết 3,5 giờ, tuy nhiên nhiệt độ và thời gian chiết có ảnh hưởng rõ rệt đến độ nhớt của dung dịch alginate [99]. Năm 2002, nhóm tác giả đã thiết lập ba bước chính trong sản xuất alginate qui mô pilot [98]: chuyển acid alginic thành sodium alginate; làm khô và nghiền nhỏ. Nhiệt độ và thời gian tốt nhất để làm khô alginate xuống độ ẩm 12% là 60oC trong 2,5 giờ; ảnh hưởng của nhiệt độ làm khô đến độ nhớt của dung dịch alginate phụ thuộc vào loại alginate. Với loại alginate có độ nhớt thấp, nhiệt độ làm khô không ảnh hưởng, còn đối với loại alginate có độ nhớt cao, độ nhớt sẽ giảm từ 40 ÷ 54% khi thay đổi nhiệt độ làm khô từ 60 ÷ 80oC.
Năm 2005, các nhà khoa học Liên Bang Nga đã đưa ra một quy trình công nghệ phức hợp chế biến rong nâu cho phép thu nhận đồng thời các chế phẩm riêng biệt, đó là các acid (acid alginic, polymannuronic acid), các polysaccharide trung tính (fucoidan, laminaran) và các chế phẩm làm giàu của các chất có hoạt tính sinh học trọng lượng phân tử thấp [154]. Quy trình bao gồm các bước sau: 1) Xử lý rong với cồn để thu nhận các hợp chất trọng lượng phân tử thấp tan trong cồn và bã rong lần 1; 2) Tách phân đoạn cồn; 3) Phân đoạn cồn được cho bay hơi để thu dung dịch làm giàu chứa các hợp chất trọng lượng phân tử thấp có hoạt tính sinh học; 4) Chiết bã rong lần 1 với một dung dịch nước ở pH < 6, để thu được một dịch chiết lần 1 với nước và bã rong lần 2; 5) Cô đặc dịch chiết nước lần 1 và chỉnh pH dung dịch chiết về 5 ÷ 8 thu được phân đoạn chứa hỗn hợp laminaran và fucoidan, tủa với cồn sau đó tách riêng fucoidan và laminaran; 6) Chiết bã rong biển lần 2 với nước. Cô đặc dung dịch chiết lần 2 và sấy khô thu được một phân đoạn polysaccharide chứa hỗn hợp laminaran, fucoidan và polymannuronic acid. Chỉnh pH của dịch chiết về 2,5 để kết tủa acid mannuronic còn lại fucoidan và laminaran tan trong nước. Trung hòa dung dịch còn lại sau khi tách tủa và tách tủa với cồn thu được phân đoạn polysaccharide có chứa fucoidan và laminaran và bã rong lần 3; 7) Xử lý bã rong lần 3 với NaHCO3 sau đó kết tủa với cồn thu được alginate.
1.2.3.2. Các nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu tách chiết alginate ở nước ta được thực hiện lần đầu tiên vào năm 1961 dùng trong ngành dệt. Năm 1966, bộ môn Chế biến Trường Đại học Thủy sản đã tách chiết alginate từ rong mơ vùng biển Hải Phòng và đã ứng dụng vào việc in hoa trên vải.
Năm 1978, quy trình sản xuất alginate bán cơ giới năng suất 10tấn/năm tại Xí nghiệp Chế biến Hải sản Hạ Long, Hải Phòng, đây là cơ sở sản xuất alginate lớn nhất nước ta, tuy nhiên vì nhiều lý do phân xưởng sau đó ngừng sản xuất [14].
Năm 1999, Ngô Đăng Nghĩa đã nghiên cứu tối ưu hóa qui trình công nghệ sản xuất alginate từ rong mơ Việt Nam và ứng dụng nó trong một số lĩnh vực sản xuất [16]. Trong nghiên cứu tác giả tiến hành tách chiết alginate theo qui trình acid hóa và kết quả nghiên cứu như sau: Với rong S. mcclurei: điều kiện nấu chiết alginate tối ưu là: nồng độ Na2CO3 từ 1,54 ÷ 1,68%; tỷ lệ dung dịch chiết gấp 20 lần rong khô; nhiệt độ nấu chiết 55 ÷ 60oC; thời gian nấu chiết 1,15 ÷ 2,2 giờ. Kết quả sản phẩm thu được ở điều kiện tách chiết tối ưu là: Độ nhớt dung dịch alginate 1%: 2.165 ÷ 2.998 cP; hiệu suất quy trình: 34 ÷ 35,87%. Với rong S. kjellmanianum điều kiện nấu chiết alginate tối ưu là:
nồng độ Na2CO3 từ 1,54 ÷ 1,68%; tỷ lệ dung dịch chiết gấp 20 lần rong khô; nhiệt độ nấu chiết 60oC; thời gian nấu 2 giờ. Kết quả sản phẩm thu nhận được ở điều kiện tách chiết tối ưu là: độ nhớt dung dịch alginate 1% là 857 ÷ 983 cP; hiệu suất quy trình 25 ÷ 30,5%.
Năm 2003, Trần Thị Luyến và cộng sự đã nghiên cứu hoàn thiện và cải tiến qui trình công nghệ sản xuất alginate theo phương pháp xử lý CaCl2 0,1% từ 2 loại rong nâu thu hoạch tại Hòn Chồng, Nha Trang là S. mcclurei và S. kjellmanianum. Theo kết quả nghiên cứu, rong nâu được xử lý bằng CaCl2, sau đó đem nấu và xử lý tẩy trắng. Chất lượng keo rong nâu như sau: đối với rong S. mcclurei hiệu suất 32,68%, độ nhớt 1.480 centipoise, còn đối với rong S. kjellmanianum hiệu suất 28,42%, độ nhớt 1.238 centipoise [13]. Tính đến thời điểm hiện tại, quy trình sản xuất alginate theo phương pháp xử lý CaCl2 0,1% là một công nghệ mới lần đầu tiên được nghiên cứu. Qua thực nghiệm thu được alginate có chất lượng cao và hiệu suất thu nhận không thua kém alginate thu nhận theo phương pháp sử dụng formaldehyde và chất lượng còn cao hơn alginate sản xuất theo một số phương pháp khác có trên thị trường. Mặt khác quy trình xử lý CaCl2 còn có ưu việt là giảm thiểu ô nhiễm môi trường do không sử dụng formaldehyde - chất độc có ảnh hưởng đến sức khoẻ của công nhân và ảnh hưởng xấu đến môi trường.
Năm 2008, Nguyễn Bích Hải Thủy và cộng sự đã nghiên cứu chiết tách alginate từ rong mơ S. mcclurei, sử dụng dung môi Na2CO3 0,5% và tinh chế alginate bằng cách kết tủa tạo acid alginic tự do trong dung dịch (có chứa CaCl2 2% trong HCl pH = 2), thu được sản phẩm alginate có màu nâu. Tác giả cũng xác định một cách định tính tỷ lệ M/G là khoảng 1/2, alginate giàu gốc guluronate và hình thành gel khỏe, nhưng lại giòn và dễ gãy [21].
Năm 2010, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã cùng với Viện VNITRO và PIBOC (Liên Bang Nga) thiết lập quy trình công nghệ thu nhận đồng thời fucoidan và calcium alginate từ rong mơ Việt Nam, trong đó chủ yếu là sản xuất fucoidan. Quy trình tiến hành như sau: chiết fucoidan với điều kiện chiết tối ưu: tỷ lệ rong/dung dịch chiết là 1/10 (w/v); pH của dung dịch chiết là 1,9 ÷ 2,5. Sử dụng màng siêu lọc kích thước 50 ÷ 100 kDa để đồng thời cô đặc và làm sạch dung dịch fucoidan khỏi alginate và các chất khoáng; tủa fucoidan bằng cồn 60 ÷ 70%. Sử dụng dung môi là ethanol để hòa tan tủa fucoidan dưới dạng huyền phù và tiến hành sấy phun tại nhiệt độ 65oC. Chiết calcium alginate: bã thải rong nâu (sau khi tách chiết fucoidan) thì rửa sạch acid (pH = 5,5 ÷ 6,0) rồi được phơi khô. Sau đó xử lý bã rong khô bằng dung dịch formaldehyde 1% theo tỷ lệ rong/nước là 1/10 (w/v), khuấy trộn đều, ngâm trong 24 giờ. Lọc bằng túi vải, loại bỏ dung dịch, lấy bã rong, rửa nước loại bỏ formaldehyde.
Lọc bằng vải thô, loại bỏ dung dịch, lấy bã rong rửa bằng nước đến pH = 6,0. Chiết rong bằng nước theo tỷ lệ 1/15 (w/v), sau đó chỉnh pH của huyền phù bằng Na2CO3 đến pH
= 10, khuấy nhẹ huyền phù và ngâm trong 5 giờ tại nhiệt độ phòng (25 ÷ 35oC). Pha loãng huyền phù đến khi tỷ lệ rong/nước = 1/20, lọc qua lớp diatomit. Dung dịch sau đó được đưa vào dung dịch CaCl2 10% theo tỷ lệ khối lượng CaCl2/alginate (có trong nguyên liệu thô) là 2,5/1, đồng thời khuấy nhẹ. Hỗn hợp được lọc qua lưới kim loại, rửa tủa bằng nước cất. Tẩy trắng tủa bằng dung dịch NaClO 5%, sau đó rửa tủa 03 lần bằng nước cất. Tách nước khỏi tủa bằng ép tủa dưới áp suất, sấy kết tủa tại nhiệt độ 45oC thu được calcium alginate [27].
Nhìn chung, công nghệ chiết tách alginate từ rong nâu đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Các kết quả nghiên cứu cho thấy tùy theo từng loài rong nâu mà có sự khác nhau về chế độ xử lý rong. Hiệu suất tách chiết alginate từ rong nâu phụ thuộc vào các yếu tố công nghệ như nhiệt độ nấu chiết, pH nấu chiết,... và chế độ nấu chiết sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của alginate. Độ nhớt của alginate là một trong những thông số quan trọng phản ánh chất lượng của sodium alginate thu nhận và ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận alginate. Nếu độ nhớt của alginate thấp tức alginate ngắn mạch. Khi cấu trúc mạch alginate bị cắt ngắn trong quá trình nấu chiết thì hiệu suất thu hồi alginate thấp. Sở dĩ có hiện tượng này là do alginate mạch phân tử ngắn khó bị kết tủa bởi cồn. Hiệu suất tách chiết và độ nhớt của alginate có liên quan mật thiết với nhau trong quá trình nấu chiết alginate từ rong nâu. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về công