1.3. ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới điều chế alginate khối lượng phân tử thấp
centipoise khi liều lượng chiếu xạ tăng từ 12,5; 25; 37,5 và 50 kGy. Khối lượng phân tử trung bình của alginate giảm tương ứng từ 10 kDa xuống 1 kDa [162]. Cũng bằng phương pháp này, tác giả El-Mohdy (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ từ 20 ÷ 100 kGy, đồng thời có sử dụng kết hợp với potassium per-sulfate (KPS) để giảm liều lượng chiếu xạ. Kết quả cho thấy alginate chiếu xạ có khối lượng phân tử thấp nhất ở 100 kGy và có KPS, ngược lại thì sản phẩm có khối lượng phân tử lớn khi chiếu xạ ở liều lượng 20 kGy và không có KPS [66].
Sử dụng phương pháp cắt mạch alginate bằng bức xạ tia tử ngoại (UV) kết hợp với sử dụng chất xúc tác titanium dioxide (TiO2) được Buranaosot và cộng sự (2009) nghiên cứu. Kết quả nhận thấy khối lượng phân tử trung bình của alginate sau chiếu xạ phụ thuộc vào pH, thời gian tiếp xúc tia bức xạ tử ngoại và điều kiện tối ưu cho phản ứng cắt mạch là ở pH = 7, trong 3 giờ, khối lượng phân tử trung bình của alginate giảm gần 50%, từ 198 kDa xuống còn 96 kDa [46].
Sóng siêu âm cũng có khả năng cắt mạch alginate để tạo ra các alginate khối lượng phân tử thấp. Feng và cộng sự (2017) đã sử dụng sóng siêu âm ở tần số 135 kHz để thủy phân alginate có khối lượng phân tử trung bình 192,7 kDa và kết quả tạo thành alginate có khối lượng phân tử trung bình từ 35 kDa đến 73 kDa [76]. Ở một nghiên cứu khác, Hu và cộng sự (2013) sử dụng vi sóng 1600W ở 135oC trong 15 phút để thủy phân polyguluronate có khối lượng phân tử trung bình 6,1 kDa thành guluronate có khối lượng phân tử trung bình 3,2 kDa với hiệu suất phân cắt đạt 71% [109].
Phương pháp thủy nhiệt (180 ÷ 240oC) để cắt mạch sodium alginate cũng được một số nhà khoa học nghiên cứu. Chẳng hạn, Aida và cộng sự (2010) đã sử dụng kỹ thuật thủy nhiệt (180 ÷ 240oC) để cắt mạch sodium alginate và nhận thấy quá trình cắt mạch tạo ra các oligosaccharide, monosaccharide và các sản phẩm phân hủy khác như acid lactic, acid glycolic. Quá trình cắt mạch alginate lúc đầu giải phóng các mannuronic acid và tiếp sau đó giải phóng các guluronic acid. Các monosaccharide tạo ra trong điều kiện thủy nhiệt là kết quả của tạo thành liên kết glycosid giữa các monomer với các thành phần chọn lọc khác trong chuỗi M-M, M-G và G-G hơn là các gốc tự do trong alginate. Đây được xem là phương pháp thích hợp dùng để xác định cấu trúc mạch alginate [28].
Như vậy, đa số các nhà khoa học trên thế giới đã sử dụng kỹ thuật chiếu xạ hoặc kỹ thuật đồng vận kết hợp giữa chiếu xạ và tác nhân hóa học để phân cắt alginate thành
alginate khối lượng phân tử thấp. Tuy vậy, các nghiên cứu thuộc lĩnh vực này chưa đề cập đến hoạt tính và ứng dụng vào trong lĩnh vực thực phẩm của các alginate khối lượng phân tử thấp thu được sau phân cắt.
1.3.1.2. Điều chế alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp hóa học Thủy phân alginate bằng tác nhân hóa học chẳng hạn như acid hay H2O2 đã được một số nhà nghiên cứu công bố. Haug và cộng sự (1963) cho thấy alginate bị thủy phân bởi HCl ở pH = 3,8. Quá trình cắt đứt mạch alginate thực hiện ở liên kết giữa 2 mắc xích M và G theo kiểu đứt mạch tự nhiên. Thông thường sự thủy phân được thực hiện bằng acid loãng ở 100oC trong thời gian từ 6 đến 12 giờ [92]. Trong một nghiên cứu khác, vào năm 1966 các tác giả trên đã thực hiện việc thủy phân alginate từ rong Laminaria digitata bằng acid oxalic 1M ở 100oC trong 5 giờ, điều chỉnh pH = 2,85 thu được 80 ÷ 90% phân đoạn hòa tan (mannuronic acid) và phân đoạn không hòa tan (guluronic acid) [93]. Chandía và cộng sự (2001) cũng thủy phân sodium alginate bằng HCl 0,3M và gia nhiệt ở 100oC trong 0,5 giờ, làm nguội và ly tâm lần 1. Phần không hòa tan tiếp tục thủy phân với HCl 0,3M ở 100oC trong 2 giờ, ly tâm lần 2. Phần hòa tan trong 2 lần ly tâm đem trung hòa rồi kết tủa thu được các block heteropolymeric. Phần không tan sau khi ly tâm lần 2 được trung hòa, rồi sau đó điều chỉnh pH về 2,85 sau đó ly tâm thu được hai phân đoạn giàu mannuronic acid và guluronic acid [49]. Cũng bằng phương pháp này, Sari Chmayssem và cộng sự (2015) đã thủy phân alginate từ rong nâu S. vulgare và kết quả thu được guluronate và mannuronate với hàm lượng tương ứng là 32,6% và 22,3% [188].
Thủy phân alginate bằng H2SO4 đã được Muramatsu và cộng sự (1993) nghiên cứu. Nhóm tác giả sử dụng 20 mL H2SO4 70% ở 30oC để thủy phân 2 gam mannuronate trong thời gian 25 phút và 2 gam guluronate trong 90 phút, trong quá trình thủy phân thỉnh thoảng có khuấy đảo. Kết quả nghiên cứu đã thu nhận được các oligoguluronate và oligomannuronate [164].
Điều chế acid alginic khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp thủy phân acid alginic bằng H3PO4 đã được nghiên cứu bởi Ikeda và cộng sự (2000). Theo nghiên cứu, tác giả sử dụng 5 gam acid alginic phân tán trong 85% H3PO4 (94 mL), thủy phân ở nhiệt độ phòng trong 1 đến 10 ngày. Phân đoạn không hòa tan là phân đoạn giàu polyguluronic acid được tách ra bằng cách lọc. Phần dịch lọc được cho vào 400 mL nước. Phần không tan trong nước được tách ra bằng phương pháp lọc, thu được phân
đoạn giàu polymannuronic acid. Đối với phần hòa tan trong nước tiếp tục cho vào 2 lít methanol thu được kết tủa là phân đoạn luân phiên của polymannuronic acid và guluronic acid [112].
Thủy phân alginate bằng H2O2 được Li và cộng sự (2010) nghiên cứu và thu được các alginate có khối lượng phân tử thấp. Alginate có khối lượng phân tử trung bình 254,5 kDa sau khi xử lý H2O2 ở 50oC và 80oC thì khối lượng phân tử trung bình của alginate còn lại tương ứng là 230 kDa và 143 kDa [132].
Bên cạnh việc sử dụng acid thủy phân alginate thu được các alginate khối lượng phân tử thấp. Quá trình cắt mạch alginate còn diễn ra dưới tác động của tác nhân kiềm.
Haug và cộng sự (1963) nghiên cứu thấy rằng alginate bị thủy phân cắt mạch ở môi trường pH = 12 và quá trình cắt mạch diễn ra một cách tự nhiên [92]. Còn theo nghiên cứu của Niemela và cộng sự (1985) đã cho thấy tùy theo nồng độ kiềm xử lý mà hàm lượng acid carboxylic được hình thành tương ứng từ 30 ÷ 70% so với alginate ban đầu, do xảy ra phản ứng -elimination cắt mạch alginate [167].
1.3.1.3. Điều chế alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp enzyme Họ enzyme thủy phân cắt mạch alginate (alginate lyase) có hơn 50 loại khác nhau, được thu nhận từ rong biển, động vật biển không xương sống, vi sinh vật có nguồn gốc từ biển và từ đất. Enzyme thuộc nhóm này gồm có enzyme thủy phân cắt mạch mannuronate (mannuronate lyase) (EC.4.2.2.3) và enzyme thủy phân cắt mạch guluronate (guluronate lyase) (EC 4.2.2.11), đặc hiệu cắt đứt liên kết (14) glycosidic theo kiểu -elimination.
Nghiên cứu sử dụng enzyme để thủy phân alginate thành các alginate khối lượng phân tử thấp đã được một số tác giả công bố. Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy đó là quá trình thủy phân có tính chọn lọc. Khả năng cắt mạch alginate bởi enzyme từ các nguồn khác nhau cho thấy chúng có tính đặc hiệu: có loại enzyme chỉ thể hiện tính đặc hiệu thủy phân đối với liên kết của block acid guluronic, có loại enzyme thể hiện tính đặc hiệu thủy phân đối với block acid mannuronic. Tuy nhiên, cũng có loại enzyme có khả năng thủy phân đặc hiệu đối với liên kết giữa acid mannuronic và acid guluronic.
Những enzyme có khả năng thủy phân đặc hiệu block guluronic acid đã được nghiên cứu như enzyme thủy phân alginate thu nhận từ vi khuẩn phân lập từ rong S.
fluitans, enzyme có khối lượng phân tử 38 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,5 và hoạt động
mạnh khi có mặt của NaCl 0,5M [45]. Enzyme thủy phân alginate thu nhận từ loài vi khuẩn Enterobacter cloacae M-1 có khối lượng phân tử 38 kDa và 32 kDa, pI = 8,9, pH thích hợp là 7,8, nhiệt độ thích hợp là 30oC, enzyme không bền với nhiệt, EDTA hoàn toàn ức chế hoạt tính của enzyme, nhưng hoạt tính của enzyme phục hồi lại được khi xử lý với CaCl2 [166].
Những enzyme có khả năng thủy phân đặc hiệu block mannuronic acid đã được nghiên cứu. Người ta nghiên cứu và nhận thấy enzyme thu nhận từ loài vi khuẩn Pseudomonas syringae thích hợp để deacetyl acid mannuronic, có điều kiện thích hợp cho hoạt động: pH = 7, nhiệt độ 42oC, NaCl 0,2M [174]. Cả 2 loại enzyme thủy phân cắt mạch alginate AkAly28 và AkAly33 thu nhận từ loài Sên biển Aplysia kurodai có khối lượng phân tử tương ứng 28 kDa và 33 kDa đều có tác dụng thủy phân đối với mannuronate. Nhiệt độ và pH thích hợp cho cả 2 enzyme này tương ứng là ở 40oC và 6,7 [177]. Đối với enzyme thủy phân alginate thu nhận từ loài vi khuẩn Pseudomonas alginovora chỉ tác dụng vào bộ đôi block M-M, nhưng không tác động vào giữa các block M-MG, G-MM, hoặc G-MG [142].
Những enzyme có khả năng xúc tác đặc hiệu đối với cả block M và block G đã được một số nhà khoa học nghiên cứu, như: enzyme thu nhận từ loài vi khuẩn Alteromonas sp. strain H-4 phân lập từ rong nâu Laminaria có khối lượng phân tử 32 kDa, pI = 4,7, với hệ số Km (mg/mL) trong khoảng 20 lần [189]. Enzyme thu nhận từ loài vi khuẩn Vibrio sp. YKW-34 có khối lượng phân tử 60 kDa, pI = 5,5 ÷ 5,7, pH thích hợp là 7,0 và nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme ở 40oC. Enzyme này ổn định trong pH = 7,0 ÷ 10,0 và nhiệt độ dưới 50oC, nhưng nó hoàn toàn bị mất hoạt tính bởi quá trình thẩm tách và khi tiếp xúc với Na+ hoặc K+ ở nồng độ 0,1M [82]. Enzyme tách chiết từ loài vi khuẩn Pseudoalteromonas sp. SM0524 phân lập từ tảo bẹ có khối lượng phân tử 32 kDa, nhiệt độ thích hợp 50oC và pH thích hợp là 8,5. Enzyme này được đánh giá là có triển vọng tốt trong sản xuất dimer và trimer từ alginate [129]. Enzyme thu nhận từ loài vi khuẩn có trong nước biển Sphingomonas sp. MJ-3 có khả năng thủy phân alginate thành các alginate monosaccharide và vi khuẩn sử dụng alginate monosaccharide như là nguồn carbon. Hỗn hợp các monosaccharide đạt đến 3,3 mg/mL từ 1% alginate (w/v) khi dùng 200 g/mL enzyme thủy phân alginate ở 30oC và pH=
6,5 [185]. Enzyme thu nhận từ loài vi khuẩn Flavobacterium sp. có khả năng thủy phân alginate và có điều kiện thích hợp cho hoạt động là pH = 7 và nhiệt độ 40oC. Quá trình
thủy phân dung dịch alginate 0,8% diễn ra mạnh mẽ và tạo ra oligosaccharide có độ polymer hóa trung bình (DP) là 6,0 có tác dụng ức chế hoạt động của Pseudomonas aeruginosa [32].
Ogura và cộng sự (2008) cũng tách chiết được enzyme thủy phân alginate từ loài vi khuẩn Sphingomonas sp. A1, enzyme này có khả năng thủy phân α-L-guluronate, β- D-mannuronate và heteropolymer trong phân tử alginate [169].