CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.6. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SGS
3.6.1. Đánh giá hoạt tính chống đông máu in vitro của SGS
Hoạt tính chống đông máu thể hiện qua các chỉ số thời gian đông máu nội sinh (APTT), thời gian đông máu ngoại sinh (PT) và thời gian đông máu chung (TT). Trong điều kiện bình thường, thời gian đông máu nội sinh (APTT), thời gian đông máu ngoại sinh (PT) và thời gian đông máu chung (TT) tương ứng trong khoảng 26,3 giây, 11,5 giây và 10,6 giây [131], [222]. Khi có mặt của chế phẩm SGS thì hoạt tính chống đông máu có sự thay đổi và kết quả nghiên cứu được trình bày dưới đây.
a. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử trung bình của SGS đến hoạt tính chống đông máu.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử trung bình của SGS đến hoạt tính chống đông máu được trình bày ở hình 3.37
Hình 3.37. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử trung bình của SGS đến thời gian đông máu
Từ kết quả phân tích ở hình 3.37 cho thấy:
+ Thời gian đông máu ngoại sinh (PT) hầu như không thay đổi đạt ở 28,6 giây trong phạm vi khối lượng phân tử trung bình của SGS từ 15 kDa đến 35 kDa.
+ Thời gian đông máu chung (TT) tăng lên từ 31 giây lên 45 giây tương ứng khi khối lượng phân tử trung bình của SGS từ 15 kDa đến 25 kDa. Tuy nhiên, khi khối lượng phân tử trung bình của SGS là 35 kDa thì thời gian đông máu chung (TT) giảm xuống còn 35 giây.
+ Thời gian đông máu nội sinh (APTT) tăng lên từ 155 giây lên 177 giây tương ứng khi khối lượng phân tử trung bình của SGS từ 15 kDa đến 25 kDa. Tuy nhiên, khi khối lượng phân tử trung bình của SGS ở 35 kDa thì thời gian đông máu nội sinh (APTT) giảm xuống còn 155 giây.
Kết quả nghiên cứu của luận án về ảnh hưởng của khối lượng phân tử trung bình đến hoạt tính chống đông máu của SGS cũng có kết quả tương đồng với các nghiên cứu đã công bố trước đây và cho thấy hoạt tính chống đông máu của các polysaccharide sulfate phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình. Cụ thể là theo kết quả nghiên cứu của Pulawat và cộng sự (2014) cho thấy hoạt tính chống đông máu của alginate sulfate và phân đoạn alginate sulfate bị ảnh hưởng bởi khối lượng phân tử, cụ thể, thời gian
155 177
155
28.6 28.6 28.6
31
45 35
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
15 25 35
APTT PT TT
Thờigian (giây)
Khối lượng phân tử trung bình (kDa)
đông máu nội sinh (APTT) của alginate sulfate (AlS) và phân đoạn alginate sulfate (AlHS) có khối lượng phân tử dưới 36 kDa và 27 kDa thì thời gian đông máu nội sinh (APTT) tương ứng là 287 giây và 102 giây ở nồng độ 75 g/mL; không có tác dụng kéo dài thời gian đông máu ngoại sinh (PT) [175]. Theo kết quả nghiên cứu của Wang và cộng sự (2007) cho thấy hoạt tính chống đông máu của sodium xenlulo sulfate có khối lượng phân tử trung bình từ 11 kDa đến 35 kDa có tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) và thời gian đông máu chung (TT), nhưng khả năng kéo dài thời gian đông máu ngoại sinh (PT) là rất thấp [222]. Huang và cộng sự (2003) cho thấy hoạt tính chống đông máu của chitosan sulfate thể hiện tốt nhất ở khối lượng phân tử trung bình là 34,9 kDa, trong đó chủ yếu là kéo dài thời gian đông máu chung (TT) và thời gian đông máu nội sinh (APTT), còn tác dụng kéo thời gian đông máu ngoại sinh (PT) nhìn chung rất thấp [111].
Từ những phân tích trên cho thấy khối lượng phân tử trung bình của SGS mà luận án sản xuất có ảnh hưởng đến hoạt tính chống đông máu. Chế phẩm SGS thể hiện hoạt tính chống đông máu tốt nhất khi khối lượng phân tử trung bình là 25 kDa và chủ yếu có tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) và thời gian đông máu chung (TT), tuy nhiên ít có ảnh hưởng đến thời gian đông máu ngoại sinh (PT). Do vậy luận án chọn loại SGS khối lượng phân tử trung bình 25 kDa, có độ thay thế (DS) là 1,8 để tiếp tục nghiên cứu hoạt tính chống đông máu.
b. Ảnh hưởng của nồng độ SGS đến hoạt tính chống đông máu
Hoạt tính kháng đông máu của SGS thể hiện cao nhất ở khối lượng phân tử trung bình là 25 kDa. Do vậy, luận án tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nồng độ SGS (có khối lượng phân tử trung bình 25 kDa, độ thay thế (DS) là 1,8) đến hoạt tính chống đông máu với cỏc nồng độ 25 àg/mL, 50 àg/mL và 75 àg/mL. Kết quả nghiờn cứu được trỡnh bày ở hình 3.38.
Từ kết quả phân tích ở hình 3.38 cho thấy:
- Thời gian đông máu ngoại sinh (PT) của chế phẩm ở các nồng độ đã thử nghiệm trong khoảng từ 25 àg/mL đến 75 àg/mL hầu như khụng khỏc biệt nhau và dao động trong khoảng 21 giây và 22 giây.
- Thời gian đông máu chung (TT) của chế phẩm SGS thay đổi theo nồng độ SDS đó thử nghiệm. Cụ thể tương ứng với cỏc nồng độ SGS là 25 àg/mL, 50 àg/mL và 75 àg/mL thỡ thời gian đụng mỏu chung tương ứng là 30 giõy, 41 giõy và 43 giõy.
Hình 3.38. Ảnh hưởng của nồng độ SGS có khối lượng phân tử trung bình 25 kDa đến thời gian đông máu
- Thời gian đông máu nội sinh (APTT) của chế phẩm SGS cũng thay đổi tùy thuộc vào nồng độ sử dụng và nồng độ SGS càng cao thì thời gian đông máu nội sinh càng cao. Cụ thể, tương ứng với nồng độ chế phẩm SGS là 25 àg/mL, 50 àg/mL và 75 àg/mL thời gian đông máu nội sinh là 152 giây, 153 giây và 170 giây.
Như vậy, nồng độ của chế phẩm SGS (có khối lượng phân tử trung bình 25 kDa) có ảnh hưởng đến thời gian đông máu. So sánh với heparin có thời gian đông máu nội sinh (APTT) ở cỏc nồng độ 10 àg/mL và 50 àg/mL tương ứng là 138,7 ± 3 giõy và lớn hơn 200 giây [131]. Như vậy, tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) của SGS thấp hơn so với heparin. Bên cạnh đó, thời gian đông máu nội sinh (APTT) của chế phẩm SGS cũng thấp hơn thời gian đông máu nội sinh (APTT) của alginate sulfate (AS) có khối lượng phân tử trung bình 47,3 kDa. Thể hiện ở chỗ, tương ứng với nồng độ của alginate sulfate (AS) cú khối lượng phõn tử trung bỡnh 47,3 kDa là 10 àg/mL, 33 àg/mL và 67 àg/mL thỡ thời gian đụng mỏu nội sinh tương ứng là 125 giõy, 455 giõy và 24 phỳt [181]; hay Polyguluronate sulfate khối lượng phân tử thấp (LPGS - Low-molecular- weight polyguluronate sulfate) được sulfate hóa từ polyguluronate có khối lượng phân tử trung bỡnh 11,4 kDa, khi sử dụng ở nồng độ 50 àg/mL thỡ thời gian đụng mỏu nội sinh (APTT) là 188,67 giây [240], trong khi đó alginate sulfate (AlS) có khối lượng phân
152 153
170
21 21.5 22
30
41 43
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
25 50 75
APTT PT TT
Nồng độ (μg/mL)
Thờigian (giây)
tử dưới 36 kDa ở nồng độ 50 àg/mL cú thời gian đụng mỏu nội sinh (APTT) lờn tới 288 giây [175].
Tuy nhiên, tác dụng kép dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) của chế phẩm SGS gần tương đương với tác dụng của propylene glycol mannuronate sulfate (PGMS) được sulfate hóa từ polymannuronate hiện đang được sử dụng làm thuốc chống đông máu (antithrombotic) ở Trung Quốc [192] (chế phẩm này có khối lượng phân tử trung bỡnh 12,6 kDa và thời gian đụng mỏu nội sinh (APTT) ở 50 àg/mL là 144,89 giõy). Đặc biệt, tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) của chế phẩm SGS nghiên cứu của luận án có thời gian dài hơn so với AlHS (có khối lượng phân tử trung bình dưới 27 kDa, ở nồng độ 75 àg/mL cú thời gian đụng mỏu nội sinh là 102 giõy) [175].
Thời gian đông máu chung (TT) của chế phẩm SGS trong khoảng 41 giây đến 43 giõy ở cỏc nồng độ 25 àg/mL, 50 àg/mL và 75 àg/mL. So với heparin, thời gian đụng máu chung (TT) của SGS thấp hơn thời gian đông máu chung của heparin (ở các nồng độ 10 àg/mL và 50 àg/mL heparin cú thời gian đụng mỏu chung tương ứng là 69,2 ± 3,2 giây và lớn hơn 120 giây) [131], cũng thấp hơn thời gian đông máu chung (TT) của CP2-1 (thời gian đụng mỏu chung của CP2-1 thể hiện ở nồng độ 50 àg/mL là 68,7 ± 3,3 giây) [131]. Tuy nhiên, thời gian đông máu chung (TT) của chế phẩm SGS nghiên cứu của luận án có thời gian dài hơn thời gian đông máu chung của AS (khối lượng phân tử trung bỡnh 47,3 kDa và ở cỏc nồng độ 25 àg/mL và 50 àg/mL thỡ thời gian đụng mỏu chung (TT) tương ứng là 28 giây và 30 giây) [181].
Thời gian đụng mỏu ngoại sinh (PT) của chế phẩm SGS ở cỏc nồng độ từ 25àg/mL đến 75àg/mL dao động trong khoảng 21 giõy và 22 giõy. So với heparin, thời gian đụng máu ngoại sinh (PT) của SGS thấp hơn (thời gian đông máu ngoại sinh (PT) của heparin ở cỏc nồng độ 10 àg/mL và 50 àg/mL tương ứng là 49,4 giõy và 97,8 giõy) [131]. Tuy nhiên, thời gian đông máu ngoại sinh (PT) của SGS tương đương với thời gian đông mỏu ngoại sinh (PT) của alginate sulfate (AS) (ở cỏc nồng độ 12,5 àg/mL, 25 àg/mL và 50 àg/mL cú thời gian đụng mỏu ngoại sinh trong khoảng 20 giõy) [181].
Từ những kết quả phân tích ở trên cho thấy hoạt tính chống đông máu của chế phẩm SGS phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình và nồng độ của SGS. Hoạt tính chống đông máu của chế phẩm SGS tốt nhất khi chế phẩm SGS có khối lượng phân tử trung bình là 25 kDa và nồng độ SGS càng cao thì hoạt tính chống đông máu càng tăng.
Chế phẩm SGS có tác dụng đáng kể trong việc kéo dài thời gian đông máu nội sinh
(APTT) và thời gian đông máu chung (TT), tuy nhiên thời gian đông máu ngoại sinh (PT) hầu như không bị ảnh hưởng bởi khối lượng phân tử cũng như nồng độ của SGS.
Tác dụng kéo dài thời gian đông máu của SGS có thể được giải thích như sau: theo lý thuyết về quá trình đông máu, muốn máu đông lại phải có sự xuất hiện của fibrin, nhưng để có fibrin thì hàng chục yếu tố trước đó phải được hoạt hóa. Khi một yếu tố được hoạt hóa sẽ kéo theo sự hoạt hóa của các yếu tố khác theo kiểu phản ứng dây chuyền tự động đưa đến kết quả là hình thành nhân tố Xa (yếu tố hoạt hóa prothrombin (II) thành thrombin (IIa)). Khi thrombin được hình thành sẽ chuyển fibrinogen thành fibrin, chuyển yếu tố XIII thành XIIIa và yếu tố XIIIa này sẽ chuyển fibrin đang ở dạng hoà tan trở thành fibrin không tan. Cuối cùng là sự hình thành mạng lưới fibrin (dạng sợi) “trói buộc” hồng cầu gây nên sự đông máu. Do vậy, tác dụng chính của SGS khối lượng phân tử thấp là tham gia vào quá trình ức chế quá trình tổng hợp dạng có hoạt tính của các yếu tố đông máu như yếu tố XII và Xa [74], [127], [223] nên chỉ có tác dụng tới con đường nội sinh và đông máu chung (các yếu tố này không có trong con đường ngoại sinh).
Sodium guluronate sulfate khi thêm vào huyết tương có tác dụng kéo dài thời gian đông máu. Kết quả này cho thấy nhóm sulfate có một vai trò quan trọng trong hoạt tính chống đông máu, SGS thông qua sự kết hợp nhóm sulfate với amino acid tích điện dương để ngăn cản quá trình tập hợp của các protein tham gia quá trình đông máu. Một số nhà nghiên cứu cho rằng vai trò của nhóm sufate trong phân tử polymer (SGS) là do chúng có thể hình thành liên kết với các protein tham gia quá trình đông máu để tạo thành phức SGS - protein làm hạn chế việc đông kết giữa các protein tham gia quá trình đông máu.
Sở dĩ SGS có khối lượng phân tử trung bình thích hợp cho hoạt tính chống đông máu là do cấu trúc mạch vừa phải nên sau khi sulfate hóa sẽ thu được SGS có hàm lượng sulfate phù hợp để hình thành liên kết với protein tham gia quá trình đông máu nên hoạt tính chống đông máu sẽ cao. Tuy nhiên, khi SGS có khối lượng phân tử trung bình cao thì hoạt tính chống đông tụ máu lại thấp có thể là do SGS có khối lượng phân tử lớn và cấu trúc không gian dạng nếp gấp nên làm giảm khả năng tiếp xúc giữa các gốc sulfate với các yếu tố gây đông máu, nên tác dụng chống đông máu thấp.
Bên cạnh đó, ở nồng độ SGS cao có thể làm tăng mật độ điện tích âm kết hợp với các yếu tố đông máu (XII, XI, Prekallikrein), như vậy ở giai đoạn tiếp xúc sẽ giảm sự tiếp xúc của các yếu tố đông máu với bề mặt tiếp xúc của tiểu cầu (là bề mặt tích điện
âm), gây cản trở quá trình hoạt hóa yếu tố XII và các yếu tố khác (XI, IX) nên cuối cùng không hoạt hóa yếu tố X thành yếu tố Xa. Khi yếu tố Xa không tạo thành thì sẽ không hoạt hóa prothrombin (yếu tố II) thành thrombin (IIa). Thrombin không được tạo thành sẽ không hoạt hóa các yếu tố XI thành XIa, yếu tố VIII thành VIIIa và yếu tố V thành Va, không chuyển fibrinogen thành fibrin. Khi đó, quá trình đông máu nội sinh không xảy ra.
Kết quả nghiên cứu của Luận án cũng tương đồng với các kết quả nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính chống đông máu của các polysaccharide sulfate có liên quan với thành phần, đặc tính cấu trúc của chúng. Các alginate sulfate có khối lượng phân tử thấp có khả năng tương thích cao với các thành phần tham gia quá trình đông máu do cấu trúc của nó cũng tương tự như cấu trúc của heparin [37] nên chúng có hoạt tính chống đông máu. Tuy nhiên, khả năng thể hiện hoạt tính chống đông máu của nó phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như khối lượng phân tử, nồng độ, tỷ lệ M/G, trình tự sắp xếp các uronic [30], [133].